샘플 저장소 암 바이오 마커의 평가를 위한 유용한 툴으로 말린 혈액 및 혈 청 관광 명소

Summary

이 프로토콜 주변 혈액 및 혈 청/플라즈마 다운스트림 분석 단일 염기 다형성 (SNP) 평가 및 ELISA 분석 결과 등을 저장 하는 간단 하 고 유용한 방법을 설명 합니다.

Abstract

혈액 샘플 품질은 실시간 PCR 또는 ELISA 등 정확한 다운스트림 분석을 위해 중요 합니다. 생물 재료의 올바른 보관 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 결과 달성 하기 위해 출발점입니다. 모든 샘플 저장소 혈액 컬렉션에서 같은 방식으로 취급 한다. 수행을 분석에 따라 전체 혈액 및 혈 청 샘플 저장 되어야 한다-20 ° C 또는-80 ° C에서 사용까지. 혈액/혈 청 샘플을 피하기 위해 여러 동결-해 동 aliquoted 해야 합니다. 또 다른 중요 한 문제는 다른 한 실험실에서 운송 중 샘플 조건입니다. 드라이 아이스는 사용할 수 없습니다 또는 운송 몇 일 보다 더 오래 걸립니다, 대안 필요 합니다. 한 옵션 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하는 것입니다. 여기, 우리 혈액에 대 한 방법을 제안 및 활용 하는 혈 청 샘플 컬렉션 핏 자국 (DBS)을 건조 혈 청 반점 (DSS)를 건조. 우리는 실시간 PCR에 의해 몇몇 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)의 다운스트림 평가 위한 DBS에서 DNA를 추출 하는 절차를 개발 했다. 우리는 또한 DSS에서 eluted 단백질에서 시작 하는 ELISA 분석 결과 최적화. 이 메서드는 다른 ELISA 분석 실험 또는 단백질을 평가 하는 절차와 함께 사용할 수 있습니다.

Introduction

암 바이오 마커를 연구의 주요 목표는 새로운 생물 학적 진단, 예측 환자의 예 후 및 환자는 특정 치료에 응답 여부를 확인 하기 위해 사용할 수 있는 매개 변수 id입니다. 이 연구 분야는 혁신적인 암 치료의 발견에 대 한 기본 이며 맞춤형된 치료에 중요 한 역할.

바이오 마커 식별 및 유효성 검사의 각 단계 동안 수행 하는 절차는 안정적이 고 재현 되어야 합니다. 변환 연구의 성공 위한 초석 혈액 및 혈 청 등 생물 샘플의 올바른 스토리지입니다. 이것은 분자 생물학 실험 또는 단백질 분석 실험을 수행 하는 데 사용할 수 있는 고품질 생물 학적 자료를 얻기 향한 첫 번째 단계입니다.

강력한 데이터를 얻기 위해 충분 한 환자를 모집 하 되 연구 필요는 합니다. 모든 학회-80 ° C에서 샘플을 저장할 수 또는 드라이 아이스에 다른 국제 센터에 샘플을 보낼 수 있습니다. 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하 여 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 간단한 방법 이며 샘플^1,2의 즉시 동결을 요구 하지 않는다. 종이, 건조 하룻밤 왼쪽 및 실내 온도^1,2에서 최대 14 일 동안 저장 후에 한 방울의 혈액 또는 혈 청을 발견하실 수 있습니다. 이 연구원은 다른 실험실에 샘플을 보낼 시간을 제공 합니다. 말린된 피를 사용 하 여 명소 (DBS) 그리고 말린된 혈 청 반점 (DSS) 따라서 선진국과 개도국에서 기관 간의 협력을 단순화 수 있습니다.

사용의 용이성을 감안할 때, DBS 샘플링은 널리 이용 된다 분석 실험의 여러 종류에 serological 또는 유전 다운스트림 분석에 대 한. 예를 들어 과거에는, DBS 했다 자주 사용 에이즈 개발 도상국^1,2,3,,45에 상영. 이 저장 방법의 또 다른 장점은 손가락-거 시기, 따라서 테스트 ^6,,78을 심사 하는 신생아에 대 한 그것의 사용에서 혈액 샘플을 수집할 수 있습니다. 쉬운 샘플 처리 및 전송은 특히 원격 사이트에서 수집 된 샘플에 대 한 DBS의 이점이 더 실험실 장비입니다. 이전 발행물에서 DBS와 DSS 백인, 아프리카 환자⁹시리즈에서 비타민 D와 비타민 D 의무적인 단백질 (DBP) 테스트를 사용 우리. 우리의 아프리카 동료 드라이 아이스를 얻을 수 있었다. 두 개의 소수 민족 인구 비타민 D 경로 차이 이해 하는 생물 학적 마커 비교, 우리는 추가 필터 종이 표준 조건 하에서 저장 된 샘플을 사용 하 여 프로시저 개선. DBS/DSS 절차를 최적화 한 후 우리는 DBP와 두 동료에 환자 혈 청의 비타민 D를 분석할 수 있었다. 우리는 또한 아프리카⁹DBS와 백인에 대 한 전체 혈액에서 DNA 추출 후 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)의 수를 평가. 현재 프로토콜 고품질 혈액 샘플 ELISA 분석 실험 분자 생물학에서 배열 하는 다운스트림 분석의 종류를 영향을 주지 않고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 센터 시설 표준 저장 조건 없는 또는 사용 되 연구에서 생물 학적 자료를 관리 하는 것이 좋습니다. 다음 프로토콜 이러한 최적화 절차의 극치를 나타냅니다.

Protocol

말 초 혈액 및 혈 청 수집 하 고 건강 한 기증자와 환자는 연구에 참여를 서 면된 동의 준에서 저장 했다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 1. DBS에서 혈액 저장 혈액 샘플 컬렉션 Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5.4 mg와 3 mL 튜브에 주변 혈액 샘플의 3 mL를 수집 합니다.참고: 가능 한 한 빨리 D…

Representative Results

우리는 생물 학적 재료의 품질에 영향을 주지 않고 혈액 및 혈 청 실내 온도에서 저장 하 DBS 및 DSS 절차의 이용을 했다. 그림 1 단백질 카드 보호기 없이 혈액 및 혈액 수집 후의 예가 나와 있습니다. 확인 필터 종이에 저장 및 혈액을 elute 절차 샘플 품질 방해 하지 않습니다, 우리는 표준 저장 방법으로 비교를 수행 합니다. 우리는 프로토콜 섹션에서 ?…

Discussion

이 프로토콜은 실험실 직원 또는 혈액 샘플의 정확한 처리를 위해 필요한 인프라 없는 경우 필터 종이에 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 잠재력을 조사 합니다. 특히, 전체 혈액 또는 혈 청 표준 튜브 또는 손가락 찌 르 기에 의해 수집 된이 메서드를 사용 하 여 저장할 수 있습니다 그리고 혈액 컬렉션 직후-20 ° C 또는-80 ° C에서 샘플을 동결 필요가 없습니다. DBS/DSS/혈 무결성에 어떤 변화 없이 최?…

Materials

Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk‎	Sigma	Z761575	Useful to store samples at room temperature for downstream analyses
Falcon Serological Pipettes, 5 mL	Stem cell	#38003
50-200 µL tips	Star-Lab	S1120-8810
1.5 mL centrifuge tube	Eppendorf	4036-3204
QIAamp DNA microkit	Qiagen	56304	This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA
Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit)	Qiagen		This is reported as Lysis Buffer 1 in the text
Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit)	Qiagen		This is reported as Lysis Buffer 2 in the text
QIAamp mini elute column	Qiagen		This is reported as column in the text
AW1  (included in QIAamp DNA microkit)	Qiagen		This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT
AW2  (included in QIAamp DNA microkit)	Qiagen		This is reported as Wash Buffer 2 in the text
Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit	R&D systems	DVDBP0