أسلوب ميكروديلوشن مرق سهلة وقابلة للتكيف لفحص المركبات المضادة للفطور ومقتطفات.
أصبحت الأمراض الفطرية شرط طبية هامة في العقود الماضية، ولكن عدد الأدوية المضادة للفطور المتاحة محدودة. في هذا السيناريو، من الضروري البحث عن الأدوية الجديدة المضادة للفطور. تفاصيل البروتوكول ذكرت هنا طريقة إلى الشاشة الببتيدات لخصائصها المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3 مع بعض التعديلات لتناسب بحث الببتيدات المضادة للميكروبات كالأنواع الجديدة المحتملة. هذا البروتوكول وصف مقايسة وظيفية تقييم نشاط المركبات المضادة للفطور ويمكن تعديلها بسهولة لتناسب أي فئة خاصة من الجزيئات قيد التحقيق. منذ فحوصات تتم في لوحات 96-جيدا باستخدام كميات صغيرة، يمكن إكمال فرز على نطاق واسع في فترة قصيرة من الزمن، لا سيما إذا أجريت في بيئة التشغيل الآلي للمكاتب. يوضح هذا الإجراء كيفية مساعدة بروتوكول سريرية موحدة وقابلة للتعديل السعي إلى مقاعد البدلاء-عمل الجزيئات الجديدة لتحسين علاج الأمراض الفطرية.
الأمراض الفطرية وقد أصبحت شاغلا هاما طبية في العقود الأخيرة، قد ارتفعت إلى حد كبير يرجع ذلك أساسا إلى ارتفاع في عدد الأفراد المناعة مثل الذين يخضعون لعلاج السرطان، وأولئك الذين يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز أو زرع أجهزة1،2. ومع ذلك، مجموعة محدودة جداً من الأدوية المضادة للفطور المتاحة وتزايد عدد التقارير بشأن المقاومة الفطرية لهم تساهم المشاكل الرئيسية المتعلقة بالعلاجات الجهازية mycoses3.
هي مصدر محتمل للمركبات المضادة للفطور الجديدة الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، الببتيدات الموجبة الصغيرة التي تنتجها العديد من الكائنات الحية كجزء من استجابتها المناعة الفطرية للإصابة4. ومع ذلك، أسلوب الفحص لاختبار هذه المركبات ضد مسببات الأمراض الفطرية ليست موحدة. وقد استخدمت إجراءات مختلفة لتقييم نشاط مضاد للمكاتب الإقليمية للمرأة، أحياناً لنفس نموذج الكائنات الدقيقة5،،من67. هذه الاختلافات وعدم التفصيل في بعض البروتوكولات تعقد مقارنات بين المركبات ويعوق إمكانية تكرار نتائج.
طريقة واحدة لتوحيد معايير اختبار المرشحين المخدرات الجدد اتباع المبادئ التوجيهية المستخدمة لتحديد قابلية المضادة للفطور في إعدادات السريرية، مثل السريرية والمبادئ التوجيهية معهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3. ومع ذلك، هذه الاختبارات حساسية الفطريات تقييدية للغاية، ولا تأخذ في الاعتبار التباين في الأيض عبر الأنواع، كما أنشئت فقط لعدد قليل من العوامل المختارة. على سبيل المثال، أنها لا تراعي احتياجات الأيضية للخمائر غير تخمر.
هذا البروتوكول يسمح تقييم نشاط مركبات المضادة للفطور المحتملين، وتنفذ هنا للبحث عن الببتيدات المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية كلسي M27-A3 مع التعديلات التي تحسين فحص المركبات الجديدة8،9. تسمح هذه التغييرات لاستخدام كميات صغيرة من المجمع، التغيرات في درجة الحرارة أو العدوى الأولية، ووسائل الإعلام المختلفة للنمو قبل الاختبار الأمثل، بينما توحيد النتائج مع استخدام الأنواع المرجعية كعناصر تحكم. هذا الأسلوب، مع استخدام لوحات الثقافة المتعددة جيدا، ويجعل من الممكن الشاشة بسرعة وبشكل موثوق عدد كبير من المركبات.
بسبب المرونة المتأصلة، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع فئات كيميائية مختلفة من المركبات وضد الكائنات الدقيقة الأخرى، مع بعض التعديلات.
اختبارات ميكروديلوشن يمكن تحليل النشاط المضادة للفطور المحتملة من مجمع باستخدام كميات صغيرة من المجمع المستهدف، وفي نفس الوقت باختباره في طائفة من التركيزات. وبناء على ذلك، يوصي بهذا البروتوكول كخطوة أولى في الفحص للمركبات المضادة للفطور الجديدة المحتملة. البروتوكول المعروضة هنا يستند…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر الرؤوس-البرازيل، CNPq-البرازيل، يندرج/مدافع للدعم المالي. ونحن ممتنون “الدكتور هوغو كوستا آيس” لتنقيح هذه المخطوطة.
Media and Reagents | |||
RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
Antifungal drugs | |||
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
Plastics | |||
50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
Equipment and other materials | |||
Optical microscope | Nikon | E200MV | |
Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
Multichannel pipette | HTL | 5123 |