ميكروديلوشن مرق في المختبر الفرز: طريقة سهلة وسريعة للكشف عن المركبات المضادة للفطور جديدة
Summary
أسلوب ميكروديلوشن مرق سهلة وقابلة للتكيف لفحص المركبات المضادة للفطور ومقتطفات.
Abstract
أصبحت الأمراض الفطرية شرط طبية هامة في العقود الماضية، ولكن عدد الأدوية المضادة للفطور المتاحة محدودة. في هذا السيناريو، من الضروري البحث عن الأدوية الجديدة المضادة للفطور. تفاصيل البروتوكول ذكرت هنا طريقة إلى الشاشة الببتيدات لخصائصها المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3 مع بعض التعديلات لتناسب بحث الببتيدات المضادة للميكروبات كالأنواع الجديدة المحتملة. هذا البروتوكول وصف مقايسة وظيفية تقييم نشاط المركبات المضادة للفطور ويمكن تعديلها بسهولة لتناسب أي فئة خاصة من الجزيئات قيد التحقيق. منذ فحوصات تتم في لوحات 96-جيدا باستخدام كميات صغيرة، يمكن إكمال فرز على نطاق واسع في فترة قصيرة من الزمن، لا سيما إذا أجريت في بيئة التشغيل الآلي للمكاتب. يوضح هذا الإجراء كيفية مساعدة بروتوكول سريرية موحدة وقابلة للتعديل السعي إلى مقاعد البدلاء-عمل الجزيئات الجديدة لتحسين علاج الأمراض الفطرية.
Introduction
الأمراض الفطرية وقد أصبحت شاغلا هاما طبية في العقود الأخيرة، قد ارتفعت إلى حد كبير يرجع ذلك أساسا إلى ارتفاع في عدد الأفراد المناعة مثل الذين يخضعون لعلاج السرطان، وأولئك الذين يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز أو زرع أجهزة1،2. ومع ذلك، مجموعة محدودة جداً من الأدوية المضادة للفطور المتاحة وتزايد عدد التقارير بشأن المقاومة الفطرية لهم تساهم المشاكل الرئيسية المتعلقة بالعلاجات الجهازية mycoses3.
هي مصدر محتمل للمركبات المضادة للفطور الجديدة الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، الببتيدات الموجبة الصغيرة التي تنتجها العديد من الكائنات الحية كجزء من استجابتها المناعة الفطرية للإصابة4. ومع ذلك، أسلوب الفحص لاختبار هذه المركبات ضد مسببات الأمراض الفطرية ليست موحدة. وقد استخدمت إجراءات مختلفة لتقييم نشاط مضاد للمكاتب الإقليمية للمرأة، أحياناً لنفس نموذج الكائنات الدقيقة5،،من67. هذه الاختلافات وعدم التفصيل في بعض البروتوكولات تعقد مقارنات بين المركبات ويعوق إمكانية تكرار نتائج.
طريقة واحدة لتوحيد معايير اختبار المرشحين المخدرات الجدد اتباع المبادئ التوجيهية المستخدمة لتحديد قابلية المضادة للفطور في إعدادات السريرية، مثل السريرية والمبادئ التوجيهية معهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3. ومع ذلك، هذه الاختبارات حساسية الفطريات تقييدية للغاية، ولا تأخذ في الاعتبار التباين في الأيض عبر الأنواع، كما أنشئت فقط لعدد قليل من العوامل المختارة. على سبيل المثال، أنها لا تراعي احتياجات الأيضية للخمائر غير تخمر.
هذا البروتوكول يسمح تقييم نشاط مركبات المضادة للفطور المحتملين، وتنفذ هنا للبحث عن الببتيدات المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية كلسي M27-A3 مع التعديلات التي تحسين فحص المركبات الجديدة8،9. تسمح هذه التغييرات لاستخدام كميات صغيرة من المجمع، التغيرات في درجة الحرارة أو العدوى الأولية، ووسائل الإعلام المختلفة للنمو قبل الاختبار الأمثل، بينما توحيد النتائج مع استخدام الأنواع المرجعية كعناصر تحكم. هذا الأسلوب، مع استخدام لوحات الثقافة المتعددة جيدا، ويجعل من الممكن الشاشة بسرعة وبشكل موثوق عدد كبير من المركبات.
بسبب المرونة المتأصلة، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع فئات كيميائية مختلفة من المركبات وضد الكائنات الدقيقة الأخرى، مع بعض التعديلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختبارات ميكروديلوشن يمكن تحليل النشاط المضادة للفطور المحتملة من مجمع باستخدام كميات صغيرة من المجمع المستهدف، وفي نفس الوقت باختباره في طائفة من التركيزات. وبناء على ذلك، يوصي بهذا البروتوكول كخطوة أولى في الفحص للمركبات المضادة للفطور الجديدة المحتملة. البروتوكول المعروضة هنا يستند…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الرؤوس-البرازيل، CNPq-البرازيل، يندرج/مدافع للدعم المالي. ونحن ممتنون “الدكتور هوغو كوستا آيس” لتنقيح هذه المخطوطة.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
Riferimenti
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
