Un metodo di microdilution del brodo facile e adattabile per lo screening di composti Antifungini ed estratti.
Le infezioni fungine sono diventati un’importante condizione medica negli ultimi decenni, ma il numero di farmaci antifungini disponibili è limitato. In questo scenario, è necessaria la ricerca di nuovi farmaci antifungini. Il protocollo qui riportato i dettagli di un metodo a peptidi di schermo per le loro proprietà antifungine. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dagli orientamenti Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con modifiche per soddisfare la ricerca di peptidi antimicrobici come potenziale nuovi anti-fungine. Questo protocollo descrive un’analisi funzionale per valutare l’attività dei composti Antifungini e può essere facilmente modificato per soddisfare una particolare classe di molecole in esame. Poiché le analisi vengono eseguite in piastre da 96 pozzetti utilizzando piccoli volumi, uno screening su larga scala può essere completato in un breve lasso di tempo, soprattutto se effettuate in un contesto di automazione. Questa procedura illustra come un protocollo clinico standardizzato e regolabile può aiutare il banco di lavoro perseguimento di nuove molecole per migliorare la terapia di malattie fungine.
Le infezioni fungine sono diventati un’importante preoccupazione medica negli ultimi decenni, avendo aumentato considerevolmente principalmente a causa di un aumento del numero di individui immunocompromessi, come quelli sottoposti a trattamento del cancro e coloro che vivono con l’HIV/AIDS o trapiantati organi1,2. Tuttavia, una gamma molto limitata di farmaci antifungini disponibili e il numero aumentante dei rapporti sulla resistenza fungina a loro contribuiscono ai grandi problemi per quanto riguarda la terapeutica di micosi sistemiche3.
Una potenziale fonte di nuovi composti antifungini sono peptidi antimicrobici (amp), piccoli peptidi cationici prodotte da molti organismi come parte della loro risposta immunitaria innata a infezione4. Tuttavia, il metodo di screening per testare questi composti contro i patogeni fungini non è standardizzato. Le procedure differenti sono state usate per valutare l’attività antifungina di ampere, a volte per il modello stesso microrganismo5,6,7. Queste differenze e la mancanza di dettaglio in alcuni protocolli complicare i confronti tra composti e ostacola riproducibilità.
Un modo per standardizzare la sperimentazione di nuovi farmaci candidati è quello di seguire le linee guida utilizzate per definire antifungosa di predisposizione nelle regolazioni cliniche, quali la clinica e linee guida Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Tuttavia, questi test di sensibilità antifungini sono troppo restrittivi e non prendono in variazione di considerazione nel metabolismo tra le specie, come essi sono stati stabiliti soltanto per alcuni agenti selezionare. Ad esempio, non prendono in considerazione le esigenze metaboliche dei lieviti non fermentanti.
Questo protocollo permette la valutazione dell’attività dei potenziali composti antifungine e viene implementato qui per la ricerca di peptidi antimicotici. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dalle linee guida CLSI M27-A3 con modifiche che ottimizzano lo screening di nuovi composti8,9. Queste modifiche consentono l’uso di piccole quantità di composto, variazioni di temperatura o inoculo iniziale e media diversi per la crescita ottimale di pre-test, standardizzando i risultati con l’uso di antimicotici di riferimento come controlli. Questo metodo, con l’uso di piastre multi-pozzetto cultura, rende possibile rapidamente e in modo affidabile a schermo un gran numero di composti.
Grazie alla sua flessibilità intrinseca, questo protocollo può essere usato con differenti classi chimiche dei composti e contro altri microrganismi, con alcuni adattamenti.
Test di microdilution può analizzare le potenziali attività antifungina di un target composto utilizzando piccole quantità del composto e allo stesso tempo testarlo in un intervallo di concentrazioni. Di conseguenza, questo protocollo è consigliato come un primo passo nello screening per potenziali nuovi composti antifungini. Il protocollo qui presentato è basato sul protocollo M27-A3, inizialmente progettato per aiutare nella selezione della terapia antifungosa in cliniche e può essere adattato ad una varietà di …
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo CAPES-Brasile, CNPq-Brasile, FAP/DF per il sostegno finanziario. Siamo grati al Dr. Hugo Costa Paes di revisione del manoscritto.
Media and Reagents | |||
RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
Antifungal drugs | |||
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
Plastics | |||
50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
Equipment and other materials | |||
Optical microscope | Nikon | E200MV | |
Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
Multichannel pipette | HTL | 5123 |