Kjøttkraft Microdilution In Vitro Screening: en enkel og rask metode for å oppdage nye soppdrepende forbindelser
Summary
En enkel og tilpasningsdyktig kjøttkraft microdilution metode for screening soppdrepende forbindelser og ekstrakter.
Abstract
Fungal infeksjoner er blitt en viktig medisinsk tilstand i de siste tiårene, men antall tilgjengelige antifungal medisiner er begrenset. I dette scenariet er etter nye antifungal medisiner nødvendig. Protokollen rapporterte her viser en metode for skjermen peptider for sine soppdrepende egenskaper. Den er basert på kjøttkraft microdilution mottakelighet test fra kliniske og Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 retningslinjer med modifikasjoner for forskning antimikrobielle peptider som potensielle nye antifungals. Dette beskriver en funksjonell analyse for å vurdere aktiviteten til soppdrepende forbindelser og kan enkelt endres for å passe en bestemt klasse av molekyler under etterforskning. Siden analyser utføres i 96-brønnen plater med små volumer, kan en storstilt screening fullføres på kort tid, spesielt hvis utført i automatisering omgivelser. Denne fremgangsmåten viser hvordan en standardisert og justerbar klinisk protokoll kan hjelpe benk-arbeid jakten på nye molekyler å forbedre behandlingen av fungal sykdommer.
Introduction
Fungal infeksjoner har blitt en medisinsk betydning i de siste tiårene, har betydelig økte hovedsakelig på grunn av en økning i antallet immunsupprimerte personer som gjennomgår behandling og de som lever med HIV/AIDS eller transplantert organer1,2. Men bidra et svært begrenset utvalg av tilgjengelige antifungal medisiner og det økende antallet rapporter om sopp motstand mot dem til store problemer angående therapeutics systemisk mycoses3.
En potensiell kilde til nye soppdrepende forbindelser er antimikrobielle peptider (ampere), små kationisk peptider produseres av mange organismer som en del av deres medfødte immunforsvaret til infeksjon4. Metoden screening teste disse forbindelser mot sopp patogener er likevel ikke standardisert. Forskjellige prosedyrer har blitt brukt til å vurdere soppdrepende aktiviteten til forsterkere, noen ganger for samme modell microorganism5,6,7. Disse forskjellene og mangel på detaljer i noen protokoller komplisere sammenligninger mellom forbindelser og vanskeliggjør reproduserbarhet.
En måte å standardisere testing av nye narkotika kandidater er å følge retningslinjene brukes til å definere soppdrepende mottakelighet i klinisk innstillinger, for eksempel kliniske og Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 retningslinjer. Men testene soppdrepende følsomhet er for restriktive, og tar ikke hensyn til betraktning variasjon i stoffskiftet tvers av arter, som de bare ble etablert for noen velger agenter. For eksempel tar de ikke hensyn til metabolske behovene til ikke-fermenting gjær.
Denne protokollen gir analysen aktivitet av potensielle soppdrepende forbindelser, og implementeres her for Søk etter soppdrepende peptider. Den er basert på kjøttkraft microdilution mottakelighet test fra CLSI M27-A3 retningslinjer med modifikasjoner som optimaliserer screening av ny forbindelser8,9. Disse endringene tillate bruk av små mengder av sammensatte, variasjoner i temperatur eller første inoculum og ulike medier for optimal pre-test vekst, samtidig standardisere resultatene med bruk av referanse antifungals som kontroller. Denne metoden med bruk av flere godt kultur plater, gjør det mulig å raskt og pålitelig skjermen en rekke forbindelser.
På grunn av iboende fleksibiliteten, kan denne protokollen brukes med forskjellige kjemiske klasser av forbindelser og mot andre mikroorganismer, med noen tilpasninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdilution tester kan analysere potensielle soppdrepende aktiviteten mål sammensatte bruker små mengder av sammensatt, og samtidig teste det i en rekke konsentrasjoner. Følgelig anbefales denne protokollen som et første skritt i screening for potensielle nye soppdrepende forbindelser. Protokollen presenteres her er basert på M27-A3 protokollen, opprinnelig laget for å hjelpe i utvalg soppdrepende terapi i klinikker, og kan tilpasses til en rekke nye soppdrepende forbindelser. Samlet kan denne protokollen fokuser…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker KAPPER-Brasil, CNPq-Brasil, FAP/DF for økonomisk støtte. Vi er takknemlige for Dr. Hugo Costa Paes for revidere manuskriptet sitt.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
Riferimenti
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
