Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos
Summary
Un método microdilución en caldo fácil y adaptable para la detección de compuestos antifúngicos y extractos.
Abstract
Infecciones por hongos se han convertido en una condición médica importante en las últimas décadas, pero el número de fármacos antifúngicos disponibles es limitado. En este escenario, la búsqueda de nuevos fármacos antifúngicos es necesaria. El protocolo reportado aquí detalla un método para péptidos de pantalla por sus propiedades antifúngicas. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con modificaciones para adaptarse a la investigación de péptidos antimicrobianos como potenciales nuevos antifúngicos. Este protocolo describe un análisis funcional para evaluar la actividad de compuestos antimicóticos y puede modificarse fácilmente para adaptarse a cualquier clase particular de moléculas bajo investigación. Puesto que los ensayos se realizan en placas de 96 pozos utilizando pequeños volúmenes, una proyección a gran escala puede completarse en un corto período de tiempo, especialmente si lleva a cabo en un entorno de automatización. Este procedimiento muestra cómo un protocolo clínico estandarizado y ajustable puede ayudar a la búsqueda Banco de trabajo de nuevas moléculas para mejorar la terapia de enfermedades causadas por hongos.
Introduction
Infecciones por hongos se han convertido en una preocupación médica importante en las últimas décadas, habiendo aumentado considerablemente debido principalmente a un aumento en el número de individuos inmunocomprometidos como los sometidos a tratamiento contra el cáncer y las personas que viven con VIH/SIDA o trasplantados de órganos1,2. Sin embargo, una gama muy limitada de los fármacos antimicóticos disponibles y el número creciente de informes sobre resistencia a los hongos les contribuyen a los grandes problemas con respecto a la terapéutica de micosis sistémicas3.
Una fuente potencial de nuevos compuestos antimicóticos son péptidos antimicrobianos (AMPs), pequeños péptidos catiónicos producidos por muchos organismos como parte de la respuesta inmune innata a infecciones4. Sin embargo, no está estandarizado el método de cribado para probar estos compuestos contra hongos patógenos. Se han utilizado diversos procedimientos para evaluar la actividad antifúngica de amperios, a veces para el mismo modelo microorganismo5,6,7. Estas diferencias y la falta de detalle en algunos de los protocolos complican las comparaciones entre reproducibilidad compuestos y cestas.
Una manera de estandarizar las pruebas de nuevos fármacos candidatos debe seguir directrices utilizadas para definir susceptibilidad antifúngica en contextos clínicos, como la clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3. Sin embargo, estas pruebas de sensibilidad a los antifúngicos son demasiado restrictivas y no tienen en variaciones de consideración en el metabolismo entre especies, ya que sólo se establecieron algunos agentes selectos. Por ejemplo, no toman en cuenta las necesidades metabólicas de las levaduras no fermentadores.
Este protocolo permite la evaluación de la actividad de potenciales compuestos antihongos y se implementa aquí para la búsqueda de péptidos antifúngicos. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las directrices del CLSI M27-A3 con modificaciones que optimizan la proyección de nuevos compuestos de8,9. Estos cambios permiten el uso de pequeñas cantidades de compuesto, las variaciones de temperatura o inóculo inicial y distintos medios para un crecimiento óptimo previo a la prueba, mientras que la estandarización de los resultados con el uso de antifúngicos de referencia como controles. Este método, con la utilización de placas de varios pocillos cultura, permite la rápida y confiable de la pantalla un gran número de compuestos.
Debido a su flexibilidad inherente, este protocolo puede utilizarse con diferentes clases químicas de los compuestos y contra otros microorganismos, con pocas adaptaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pruebas de microdilución pueden analizar la potencial actividad antifúngica de un objetivo compuesto usando pequeñas cantidades del compuesto y al mismo tiempo la prueba en una gama de concentraciones. Por consiguiente, este protocolo se recomienda como primer paso en la detección de posibles nuevos compuestos antifúngicos. El protocolo presentado aquí se basa en el protocolo M27-A3, inicialmente diseñado para ayudar en la selección de la terapia antifúngica en clínicas y puede ser adaptado a una variedad de nu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a CAPES-Brasil, CNPq-Brasil, FAP/DF para apoyo financiero. Agradecemos al Dr. Hugo Costa Paes para revisar el manuscrito.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
Riferimenti
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
