Buljongen Microdilution In Vitro Screening: en enkel och snabb metod för att upptäcka nya svampdödande föreningar
Summary
En lättarbetad och anpassningsbar buljong microdilution metod för screening svampdödande föreningar och extrakt.
Abstract
Svampinfektioner har blivit ett viktigt medicinskt tillstånd i de sista årtiondena, men antalet tillgängliga svampdödande läkemedel är begränsad. I det här fallet är sökandet efter nya svampdödande läkemedel nödvändigt. Det protokoll som redovisas här Detaljer en metod till skärmen peptider för sina svampdödande egenskaper. Den är baserad på buljong microdilution känslighet test från klinisk och Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 riktlinjerna med ändringar att passa forskningen av antimikrobiella peptider som potentiella nya antimykotika. Detta protokoll beskriver en funktionell analys för att utvärdera aktiviteten av svampdödande föreningar och kan enkelt ändras för att passa en viss klass av molekyler under utredning. Eftersom analyserna utförs i 96 brunnar med små volymer, kan en storskalig undersökning utföras i en kort tid, särskilt om utförs i automation miljö. Denna procedur illustrerar hur ett standardiserat och justerbar kliniska protokoll kan hjälpa bänk-arbete strävan efter nya molekyler att förbättra terapin av svampsjukdomar.
Introduction
Svampinfektioner har blivit en viktig medicinsk angelägenhet under de senaste decennierna har avsevärt ökat främst på grund av en ökning av antalet immunförsvagade individer såsom dem som genomgår cancerbehandling och de som lever med HIV/AIDS eller transplanterade organ1,2. Dock bidra ett mycket begränsat utbud av tillgängliga svampdödande läkemedel och det ökande antalet rapporter om svamp resistens mot dem till de stora problemen när det gäller therapeutics systemiska mykoser3.
En potentiell källa till nya svampdödande föreningar är antimikrobiella peptider (ampere), små katjoniska peptider produceras av många olika organismer som en del av sin medfödda immunsvaret mot infektion4. Trots är screeningmetoden att testa dessa föreningar mot svamp patogener inte standardiserat. Olika förfaranden har använts för att bedöma ampere, antifungal aktivitet ibland för samma modell mikroorganism5,6,7. Dessa skillnader och avsaknaden av detalj i vissa protokoll försvåra jämförelser mellan föreningar och hämmar reproducerbarhet.
Ett sätt att standardisera testning av nya läkemedelskandidater är att följa riktlinjerna används för att definiera svampdödande känslighet i kliniska inställningar, till exempel klinisk och Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Men dessa svampdödande känslighet tester är alltför restriktiv och tar inte hänsyn till övervägande variationen i metabolism mellan arter, som de inrättades endast för ett fåtal utvalda agenter. De tar exempelvis inte hänsyn de metabola behoven av icke-fermenterande jäst.
Detta protokoll kan bedömningen av aktiviteten av blivande svampdödande föreningar, och genomförs här för sökandet efter svampdödande peptider. Den är baserad på buljong microdilution känslighet test från CLSI M27-A3 riktlinjerna med modifikationer som optimerar screening av nya föreningar8,9. Dessa ändringar tillåter användning av små mängder av förening, variationer i temperatur eller inledande inokulum och olika media för optimal pre-test tillväxt, medan standardisera resultaten med användning av referens antimykotika som kontroller. Denna metod, med användning av flera väl kultur plattor, gör det möjligt att snabbt och tillförlitligt screena ett stort antal föreningar.
På grund av dess inneboende flexibilitet, kan detta protokoll användas med olika kemiska klasser av föreningar och mot andra mikroorganismer, med några anpassningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdilution tester kan analysera potentiella svampdödande aktiviteten av ett mål som är sammansatta med små mängder av föreningen och samtidigt testa den i en serie koncentrationer. Följaktligen rekommenderas detta protokoll som ett första steg i screening för potentiella nya svampdödande föreningar. Det protokoll som presenteras här bygger på protokollet M27-A3, ursprungligen konstruerad för att stöd i valet av antimykotisk terapi i kliniker, och kan anpassas till en mängd nya svampdödande föreningar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar uddar-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF för ekonomiskt stöd. Vi är tacksamma mot Dr Hugo Costa Paes för översyn av manuskriptet.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
Riferimenti
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
