Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull'acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.
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Articolo metodologico
Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cattura di ibridazione delle proteine della cromatina associate per tecnologia proteomica (HyCCAPP) è stato inizialmente sviluppata per scoprire nuove interazioni della DNA-proteina in lievito. Consente di analizzare una regione di destinazione di interesse senza la necessità di conoscenza pregressa probabile proteine legate alla regione di destinazione. Questo, in teoria, consente di HyCCAPP essere utilizzati per analizzare qualsiasi regione genomica di interesse e fornisce una flessibilità sufficiente per lavorare in diversi sistemi cellulari. Questo metodo non è destinato a siti di legame di fattori di trascrizione noti, un compito più adatto per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e ChIP-come metodi di studio. La forza di HyCCAPP sta nella sua capacità di esplorare le regioni di DNA, per cui c'è limitata o nessuna conoscenza circa le proteine legate ad esso. Può anche essere un metodo conveniente per evitare biases (presente nel ChIP-come metodi) introdotto da arricchimento di base di proteine della cromatina usando gli anticorpi. Potenzialmente, HyCCAPP può essere un potente strumento per scoprire veramente nuove interazioni della DNA-proteina. Ad oggi, la tecnologia è stata applicata principalmente di cellule di lievito o di ripetere sequenze di alta copia in cellule di mammifero. Al fine di diventare il potente strumento che noi immaginiamo, HyCCAPP approcci devono essere ottimizzate per catturare in modo efficiente copia singola loci in cellule di mammifero. Qui, presentiamo il nostro adattamento del lievito iniziale HyCCAPP protocollo di linee cellulari umane di catturare e mostrare che regioni singola copia della cromatina possono essere efficacemente isolate con questo protocollo modificato.
Introduzione
Durante la decade passata, ha visto un forte progresso nelle tecnologie di sequenziamento, permettendo lo studio di una vasta gamma dei genomi in gran numero di campioni e con sorprendente risoluzione. Il Consorzio di Enciclopedia di DNA Elements (ENCODE), uno sforzo su larga scala di multi-istituzionale guidato dal National Human Genome Research Institute, del National Institutes of Health, ha fornito le comprensioni nei fattori di trascrizione come singoli e altre proteine regolatorie associare a e interagiscono con il genoma. Lo sforzo iniziale caratterizzato interazioni DNA-proteine specifiche, come valutato da immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per oltre....
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Protocollo
1. catturare Oligonucleotide Design
-
Progettare un riquadro di oligonucleotidi da usarsi durante la cattura di ibridazione della destinazione regione/s.
- Lo scopo di progettare oligonucleotidi di 4 – 8 per regione di destinazione, ma come minimo, progettare almeno un oligonucleotide targeting per ciascuna estremità della regione di destinazione.
- Se la sequenza di destinazione è lunga (> 500 paia di basi), progettare gli oligonucleotidi come diffusione fuori come possibile per assicurare l'effettivo arricchimento della cromatina in tutta la regione intera destinazione.
Nota: Abbiamo osservato cattura ottimale con oligon....
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Risultati
A causa della necessità di grandi quantità di input della cromatina per HyCCAPP avere successo, le cellule sono coltivate a livelli relativamente elevati di confluenza. Trypan blu colorazione viene utilizzato per confermare che i tassi di morte delle cellule sono moderati (< 10%). In singola copia esperimenti, contenuto di cromatina prima ibridazione cattura deve essere nella gamma femtomolar, che di solito richiede almeno 109 celle come materiale di partenza. Prima gli espe.......
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Discussione
Il metodo di HyCCAPP qui descritto ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente approccio per scoprire interazioni DNA che altrimenti rimarrebbero sfuggente. La natura del processo dà HyCCAPP la flessibilità di lavorare in diversi organismi e regioni del genoma. Si tratta di un metodo, tuttavia, che ha diverse limitazioni da considerare.
HyCCAPP è un metodo che evita eventuali modifiche di cella in modo che potenzialmente può essere applicato in cellule primarie, sistemi di coltur.......
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Dichiarazioni
Non ci sono nessun conflitti di interesse a divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni P50HG004952 e R01GM109099 a MO.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Strumento PrimerQuest | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analizza cattura oligonucleotidi | |
| PairFold | UBC | Analizza interazioni | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillina-streptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutammina | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess contatore automatico di cellule | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 bottiglia a rullo | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Sistema a rulli | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldeide | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Ranson sonificatore digitale SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorimetro | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR kit di test | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Agilent | ||
| DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sale sodico | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Magnete Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 | Thermo Fisher | 12321D | |
| Magnete DynaMag-15 | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidina | Thermo Fisher | 60210 | |
| Tubi a basso legame | Eppendorf | 22431081 | |
| Forno di ibridazione | SciGene | ||
| Agitatore e rotatore per provette | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNasi I (senza RNasi) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC tampone 20&volte; concentrato | Sigma-Aldrich | S6639 |
Riferimenti
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res.
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Ristampe e permessi
