تحديد إذا كان الحمض النووي ملطخة "سينين صبغ يمكن هضمها" مع إنزيمات التقييد
Summary
تلوين جزيئات الحمض النووي للفحص المجهري fluorescence يسمح عالم لعرضها أثناء تجربة. في أسلوب عرض هنا، قبل ملطخة بالأصباغ الفلورية جزيئات الحمض النووي وهضمها مع مثلايشن وغير مثلايشن الحساسة تقييد الإنزيمات.
Abstract
التصور للحمض النووي للفحص المجهري الفلورية تستخدم مجموعة متنوعة من الأصباغ مثل الأصباغ سيانيني. وتستخدم هذه الأصباغ نظراً لتقارب عالية وحساسية للحمض النووي. من أجل تحديد ما إذا كانت جزيئات الحمض النووي طول كامل بعد انتهاء التجربة، مطلوب طريقة لتحديد ما إذا كانت الجزيئات الملون طول كامل بهضم الحمض النووي مع إنزيمات التقييد. ومع ذلك، قد تمنع الحمض الخلوي الصبغي الملون الإنزيمات، حيث هناك حاجة إلى طريقة لتحديد ما هي الإنزيمات واحدة يمكن استخدامها ل fluorochrome الملون الحمض النووي. في هذا الأسلوب، يتم الملون الحمض النووي مع صبغة سينين بين عشية وضحاها للسماح لصبغ والحمض النووي حجته. الحمض النووي القادم، ملطخة يهضم مع إنزيم التقييد، وتحميلها في جل واليكتروفوريسيد. تتم مقارنة العصابات هضم الحمض النووي التجريبي إلى خلاصة في السيليكون لتحديد نشاط إنزيم التقييد. إذا كان هناك نفس العدد من العصابات كما هو متوقع، ثم رد الفعل كاملة. العصابات أكثر مما كان متوقعا تشير إلى الهضم الجزئي وعصابات أقل تشير إلى غير مكتملة الهضم. وميزة هذا الأسلوب هو بساطته ويستخدم المعدات التي سوف تحتاج إلى عالم لأنزيم التقييد الاعتداء وهلام التفريد. حد من هذا الأسلوب هو أن الإنزيمات متاحة لمعظم العلماء الإنزيمات المتوافرة تجارياً؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أي إنزيمات التقييد.
Introduction
سلسلة توتو (توتو-1 ويويو-1، بوبو-1، بوبو-1، توتو-3، يويو-3، بوبو-3 وبوبو-3؛ الجدول 1) ويستخدم في مجموعة متنوعة واسعة من التجارب حيث التصور من الحمض النووي هو مطلوب1،2،3،،من45،،من67، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17-الأسرة ديمر سينين يستخدم على نطاق واسع نظراً للعائد الكم، والحساسية، وألفة عالية للحمض النووي جزيئات18،،من1920. وقد الأصباغ ديمر سينين انتقائية كبيرة لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل، وعندما أولمبية صيفية زيادة إضعاف 100 إلى 1000 من الأسفار21. بيريدينيوم الأصباغ (يويو-1 توتو-1, 3 يويو وتوتو-3) يكون طول موجي أقصر انبعاثات من كوينوليوم على صبغ النظراء (الجدول 1) (بوبو-1 بوبو-1، 3-بوبو وبوبو-3)22. أيضا، عالية المحصول الكم dimers سينين أولمبية صيفية في الحمض النووي (0.2-0.6)22. ومع ذلك، يتطلب استخدام إنزيم لتحديد التشكيل الجانبي مثلايشن من جزيء الحمض النووي2 وامتداد23 جزيء الحمض النووي فعلا ملطخة بصبغة الفلورسنت أو طريقة لتحديد ما هي الإنزيمات سوف هضم الحمض الخلوي الصبغي الملون. يمكن استخدام أي نوع من صبغة إينتيركالاتيس في الحمض النووي أو أي الإنزيم الذي يعطي نمط ملموس من الركازة الحمض النووي لهذا الأسلوب.
منغ et al. أولاً بتحديد معدل الهضم بريستاينيد الحمض النووي عن طريق التفريد جل باستخدام مجموعة متنوعة من صبغات مختلفة24. ماشمان et al. يفتش في أعمق إلقاء نظرة على الأسرة توتو من الأصباغ. سواء حددت سعر الهضم من الحمض الخلوي الصبغي الملون لمعرفة إذا كان يمكن هضمها الحمض النووي ملطخة بصبغة معينة مع إنزيم التقييد25. دراسة أساليب أخرى آثار ملزمة من الأصباغ أولمبية صيفية مع الحمض النووي باستخدام ملاقط بصرية26 أو27من الرنين المغناطيسي النووي. أما الأسلوب يتطلب معدات متخصصة؛ وحيث يسمح هذا الأسلوب بالمعدات التي لديها معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية تحديد ما إذا كانت صبغة يتداخل مع هضم إنزيم التقييد.
بالإضافة إلى ذلك، في أساليب أخرى لقياس طول جزيء معين، ممدود جزيئات الحمض النووي أونستينيد على سطح رسم الخرائط البصرية وهضم الحمض النووي لتحديد امتداد وحجم الشظايا. الالكترود صبغ قد ثبت أن زيادة طول كفاف من جزيئات الحامض النووي فلوريسسينتلي الملون واعتماداً على الصبغة المستخدمة، كفاف أطوال مختلفة21. وقد استخدمت هذا الأسلوب في مجموعة متنوعة من الجينوم1،3،،من46،13،،من2829،30، 31-ومع ذلك، ولو قبل الملون، اعتماداً على صبغ وإنزيم جزيئات، الإنزيم قد لا تكون قادرة على قطع الحمض النووي ملطخة بصبغة معينة. لذلك، يحدد هذا الأسلوب إذا كان الحمض النووي ملطخة بصبغة معينة يمكن هضمها بإنزيم. بالإضافة إلى ذلك، اعتماداً على تركيز الصبغة والصبغة المستخدمة، التنقل من الحمض النووي العصابات في جل سيتم ترحيل ببطء أكثر من الحمض النووي الأصلية بسبب تفكيك جزئي للعمود الفقري الحمض النووي لإفساح المجال لصبغ لإدراج بين قاعدة أزواج32 .
ومع ذلك، في بعض الأحيان هذه الأصباغ يمكن جزئيا أو تماما تحول دون عمل بعض الإنزيمات تقييد7،24. هذا ويعتقد أن يكون سبب تغيير هيكلي في الحمض النووي الناجم عن المرفق صبغة الفلورسنت، مما قد يمنع الإنزيم من الاعتراف تسلسل معين. يمكن أن يساعد فهم كيف تؤثر هذه الأصباغ على إنزيمات التقييد في التجارب حيث الشخصية مثلايشن أو تمتد من الحمض الخلوي الصبغي الملون مطلوب.
في أسلوبنا، ملطخة فلوروتشرومي الاهتمام الحمض النووي وهضمها مع إنزيم التقييد. ثم كان اليكتروفوريسيد الحمض النووي في هلام، المصورة، وتم قياس معدل الهضم إنزيم التقييد. تم اختيار إنزيمات التقييد بناء على النمط الذي قطع في جل. عصابات كثيرة جداً بسبب تداخل الحمض النووي العصابات وعصابات قليلة جداً لم يعط صورة كاملة من جزيء الحمض النووي. وهناك بقعة الحلو ليتمكن من تحديد التشكيل الجانبي لهضم جزيء الحمض النووي؛ ولذلك، فإنه سيتوقف على الحمض النووي المستخدمة والانزيم. ميزة هذا الأسلوب هو بساطته؛ فإنه يتطلب فقط المعدات المستخدمة في التفريد الهضم وجل تقييد.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل هضم الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي (الشكل 1)، سلسلة من الخطوات المطلوبة. أولاً، هو الملون الحمض النووي مع فلوروتشرومي بين عشية وضحاها. يمكن المحتضنة الحمض النووي مع dimers سينين لفترة أقصر من الوقت؛ ومع ذلك، وجد كارلسون et al. أن الحمض النووي إنشاء نطاقات ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث بالمعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (نيجمس) (5605100122001)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، فضلا عن جامعة نبراسكا في برنامج البحوث الطالب (SSRP) الصيف كيرني (UNK)، و UNK زمالات البحوث الجامعية (العرف).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
Riferimenti
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochimica. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. . The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
