Determinare se il DNA macchiato con un cianina tintura può essere digerito con enzimi di restrizione
Summary
Macchiatura di molecole di DNA per microscopia a fluorescenza permette uno scienziato per visualizzarli durante un esperimento. Nel metodo presentato qui, molecole di DNA sono pre-colorati con coloranti fluorescenti e digeriti con metilazione ed enzimi di restrizione sensibili non-metilazione.
Abstract
Visualizzazione del DNA per la microscopia di fluorescenza utilizza una varietà di coloranti come cianina coloranti. Questi coloranti sono utilizzati a causa della loro alta affinità e sensibilità per il DNA. Al fine di determinare se le molecole di DNA sono integrale dopo il completamento dell’esperimento, è necessario un metodo per determinare se le molecole macchiate sono integrale dalla digestione del DNA con enzimi di restrizione. Tuttavia, macchiato DNA può inibire gli enzimi, quindi è necessario un metodo per determinare quali enzimi si potrebbe utilizzare per fluorocromo macchiato del DNA. In questo metodo, il DNA è macchiato con una tintura di cianina durante la notte per consentire la tintura e il DNA per equilibrare. Prossimo, tinto il DNA è digerito con un enzima di restrizione, caricato in un gel ed electrophoresed. La band di digerire DNA sperimentali vengono confrontate con un digest in silico per determinare l’attività degli enzimi di limitazione. Se c’è lo stesso numero di bande come previsto, la reazione è completa. Più del previsto indicare digestione parziale e meno bande indicano la digestione incompleta. Il vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e utilizza attrezzature che uno scienziato avrebbe bisogno per un enzima di limitazione di analisi e di elettroforesi del gel. Una limitazione di questo metodo è che gli enzimi disponibili per la maggior parte degli scienziati sono enzimi commercialmente disponibili; Tuttavia, potrebbe essere utilizzati qualsiasi enzimi di restrizione.
Introduction
La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 e BOBO-3; Tabella 1) è utilizzata in un’ampia varietà di esperimenti dove la visualizzazione del DNA è richiesto1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la famiglia di dimero cianina è ampiamente usata a causa del loro rendimento quantico, sensibilità e alta affinità per il DNA molecole18,19,20. Cianina dimero tinture hanno grande selettività per il DNA a doppio filamento e quando intercalate hanno un aumento di 100 a 1000 volte di fluorescenza21. Piridinio coloranti (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 e TOTO-3) hanno una lunghezza d’onda di emissione che loro quinolium tingere (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 e POPO-3) controparti (tabella 1)22. Inoltre, è alto il rendimento quantico per dimeri cianina intercalato nel DNA (0.2 – 0.6)22. Tuttavia, usando un enzima per determinare il profilo di metilazione di una molecola di DNA2 o tratto23 di una molecola di DNA già macchiata con colorante fluorescente richiede un metodo per determinare quali enzimi saranno digerire DNA macchiato. Qualsiasi tipo di colorante che si intercala nel DNA o qualsiasi enzima che dà un modello distinguibile del substrato del DNA può essere utilizzato per questo metodo.
Meng et al. in primo luogo determinato il tasso di digestione del DNA precolorato attraverso elettroforesi del gel usando una varietà di differenti tinture24. Maschmann et al ha ricercato nel più profondo di guardare la famiglia TOTO di coloranti. Sia determinato il tasso di digestione del DNA macchiato per vedere se DNA tinto con un colorante specifico potrebbe essere digerito con un enzima di restrizione25. Altri metodi di studio effetti vincolanti di coloranti intercalate con DNA usando la pinzetta ottica26 o NMR27. Entrambi i metodi richiede attrezzature specializzate; mentre questo metodo consente di apparecchiature che hanno maggior parte dei laboratori di biologia molecolare per determinare se un colorante interferisce con una digestione degli enzimi di limitazione.
Inoltre, in altri metodi per misurare la lunghezza di una data molecola, mappatura ottico ha molecole di DNA non colorati su una superficie di forma allungata e digerito il DNA per determinare il tratto e le dimensioni dei frammenti. Intercalazione di tintura ha dimostrato di aumentare la lunghezza del contorno di molecole di DNA fluorescente macchiati e a seconda del colorante usato, le lunghezze di contorno sono diversi21. Questo metodo è stato utilizzato in una varietà di genomi1,3,4,6,13,28,29,30, 31. Tuttavia, se le molecole sono state pre-tinto, a seconda del colorante e l’enzima, l’enzima può non essere in grado di tagliare il DNA colorato con un colorante specifico. Pertanto, questo metodo determina se DNA tinto con un colorante specifico può essere digerito con un enzima. Inoltre, a seconda della concentrazione del colorante e la tintura utilizzata, la mobilità del DNA bande in un gel migrerà più lentamente del DNA nativo a causa lo svolgimento parziale della spina dorsale del DNA per fare spazio per la tintura da inserire tra coppie di basi32 .
Tuttavia, a volte questi coloranti possono parzialmente o completamente per inibire l’azione di alcuni enzimi di restrizione7,24. Ciò è probabilmente dovuto ad un cambiamento strutturale nel DNA causato tramite il collegamento della tintura fluorescente, che può impedire l’enzima di riconoscere la sua sequenza specifica. Comprendere come queste tinture influenzano gli enzimi di limitazione può aiutare negli esperimenti dove è richiesto il profilo di metilazione o il tratto di DNA macchiato.
Nel nostro metodo, DNA è stato macchiato con un fluorocromo di interesse e si digerisce con un enzima di restrizione. Quindi il DNA è stato electrophoresed su un gel, imaging, ed è stato misurato il tasso di digestione degli enzimi di limitazione. Gli enzimi di restrizione sono stati scelti in base al modello di taglio su un gel. Troppe fasce causato sovrapposizione delle bande di DNA e troppo poche band non ha dato un quadro completo della molecola del DNA. C’è un posto dolce per essere in grado di determinare il profilo della molecola del DNA digerito; Pertanto, essa dipenderà il DNA usato e l’enzima. Un vantaggio di questo metodo è la sua semplicità; richiede solo attrezzature utilizzate in una restrizione digestione ed elettroforesi su gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per digerire fluorescente contrassegnati del DNA (Figura 1), una serie di passaggi sono necessari. In primo luogo, il DNA è macchiato con un fluorocromo durante la notte. DNA può essere incubato con dimeri cianina per un breve periodo di tempo; Tuttavia, Carlsson et al trovato che DNA creato bands doppie per ogni dimensione del DNA a causa di colorazione incompleta20. Per risolvere questo problema, il DNA può essere macchiato durante la no…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dall’Istituto nazionale per generale Medical Science (NIGMS) (5605100122001), un componente del National Institutes of Health (NIH), così come Università del Nebraska a Kearney (UNK) estate studente ricerca programma (SSRP) e UNK Borsa di ricerca dello studente non laureato (URF).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
Riferimenti
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochimica. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. . The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
