Déterminer si l’ADN colorées avec un Cyanine colorant peuvent être digérées par les Enzymes de Restriction
Summary
Coloration des molécules d’ADN pour la microscopie de fluorescence permet de les visualiser au cours d’une expérience scientifique. Dans la méthode présentée ici, les molécules d’ADN sont pré-teint avec les colorants fluorescents et digérés par méthylation et enzymes de restriction sensibles non-méthylation.
Abstract
Visualisation de l’ADN pour la microscopie de fluorescence utilise une variété de colorants tels que colorants cyanine. Ces colorants sont utilisés en raison de leur grande affinité et la sensibilité pour l’ADN. Afin de déterminer si les molécules d’ADN pleine longueur à l’issue de l’expérience, une méthode est nécessaire pour déterminer si les molécules colorées sont pleine longueur par digestion de l’ADN avec des enzymes de restriction. Cependant, teinté d’ADN peut inhiber les enzymes, si une méthode est nécessaire pour déterminer quelles enzymes on peut utiliser pour fluorochrome ADN coloré. Dans cette méthode, l’ADN est coloré avec un colorant cyanine pendant la nuit pour permettre au colorant et l’ADN de s’équilibrer. Prochaine, vitrail de l’ADN est digéré par une enzyme de restriction, chargé un gel et PST1. Les bandes de digérer l’ADN expérimentales sont comparés à un digest en silico pour déterminer l’activité de l’enzyme de restriction. S’il y a le même nombre de bandes comme prévu, la réaction est terminée. Plus de bandes que prévu indiquent une digestion partielle et moins bandes indiquent une digestion incomplète. L’avantage de cette méthode réside dans sa simplicité, et il utilise un équipement qui aurait besoin d’un scientifique pour une enzyme de restriction de dosage et électrophorèse sur gel. Une limitation de cette méthode est que les enzymes disponibles pour la plupart des scientifiques sont disponibles dans le commerce ; Cependant, les enzymes de restriction pourrait être utilisés.
Introduction
La série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, 3-YOYO, POPO-3 et BOBO-3 ; Le tableau 1) est utilisé dans une grande variété d’expériences où la visualisation de l’ADN est nécessaire1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la famille de dimère de cyanine est largement utilisée en raison de leur rendement quantique, sensibilité et haute affinité pour l’ADN molécules18,19,20. Cyanine dimère colorants ont grande sélectivité pour l’ADN bicaténaire et quand intercalés ont une augmentation de 100 à 1000 fois de fluorescence21. Pyridinium colorants (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO et TOTO-3) ont une longueur d’onde d’émission plus courte que leur quinolium teindre (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 et POPO-3) homologues (tableau 1)22. En outre, le rendement quantique de dimères de cyanine intercalés dans l’ADN est élevé (0,2 – 0,6)22. Cependant, utilisant une enzyme pour déterminer le profil de méthylation d’un ADN molécule2 ou étirer23 d’une molécule d’ADN déjà teintée avec colorant fluorescent requiert une méthode pour déterminer quelles enzymes digèrera ADN tachée. N’importe quel type de colorant qui s’intercale dans l’ADN ou de n’importe quel enzyme qui donne une tendance discernable du substrat de l’ADN peut être utilisé pour cette méthode.
Meng et al. détermina la vitesse de digestion de marqueur ADN par électrophorèse sur gel en utilisant une variété de différents colorants24. Menad al puisé au plus profond à regarder la famille TOTO de colorants. Les deux détermine le taux de digestion de l’ADN colorée pour voir si les colorer avec un colorant donné l’ADN pourrait être digéré avec une enzyme de restriction25. Autres méthodes étudient un effet contraignant des colorants intercalées avec de l’ADN à l’aide de pinces optiques26 ou27de la NMR. Les deux méthodes besoin d’équipement spécialisé ; considérant que, cette méthode permet aux appareils disposant de la plupart des laboratoires de biologie moléculaire pour déterminer si un colorant interfère avec une enzyme de restriction digestion.
En outre, dans d’autres méthodes pour mesurer la longueur d’une molécule donnée, cartographie optique a allongé les molécules d’ADN sans tache sur une surface et digéré l’ADN afin de déterminer l’étirement et la taille des fragments de. Intercalation de colorant a été montrée pour augmenter la longueur contour des molécules d’ADN fluorescent tachées et selon le colorant utilisé, les longueurs de contour sont différents21. Cette méthode a été utilisée dans une variété de génomes1,3,4,6,13,28,29,30, 31. Toutefois, si les molécules ont été préalablement teintés, selon le colorant et l’enzyme, l’enzyme peut être pas capable de couper l’ADN teinté avec un colorant donné. Par conséquent, cette méthode détermine si les colorer avec un colorant donné l’ADN peut être digérée avec une enzyme. En outre, selon la concentration de la teinture et le colorant utilisé, la mobilité de l’ADN les bandes dans un gel vont migrer plus lentement que l’ADN natif en raison de la remise en cause partielle de l’épine dorsale de l’ADN pour faire place à la teinture à insérer entre les paires de bases32 .
Cependant, parfois ces colorants peuvent partiellement ou complètement inhibent l’action de certaines enzymes de restriction,7,24. Ceci semble être dû à un changement structurel dans l’ADN provoqué par la fixation du colorant fluorescent, qui peut-être empêcher l’enzyme de reconnaître sa séquence spécifique. Peut aider à comprendre comment ces colorants affectent les enzymes de restriction dans les expériences où le profil de méthylation ou la portion d’ADN tachée est requise.
Dans notre méthode, l’ADN a été tachée avec un fluorochrome d’intérêt et digéré par une enzyme de restriction. Puis ADN était électrophorèse sur un gel, imagé, et a mesuré la vitesse de digestion d’enzymes de restriction. Les enzymes de restriction ont été choisis sur le modèle coupé sur un gel de la base. Trop de bandes causé le chevauchement des bandes d’ADN et trop peu de bandes ne donnaient pas une image complète de la molécule d’ADN. Il y a un sweet spot pour pouvoir déterminer le profil de la molécule d’ADN digéré ; par conséquent, il dépendra de l’ADN utilisé et l’enzyme. Un avantage de cette méthode réside dans sa simplicité ; Il suffit d’équipement utilisé dans une restriction digestion et gel d’électrophorèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour digérer l’ADN fluorescent étiquetés (Figure 1), une série d’étapes sont nécessaires. Tout d’abord, l’ADN est taché avec un fluorochrome du jour au lendemain. L’ADN peut être incubée avec dimères de cyanine pendant une courte période de temps ; Cependant, Carlsson et al a conclu que les ADN créé doubles bandes pour chaque taille d’ADN en raison de la coloration incomplète20. Pour remédier à cela, l’ADN peut …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par l’Institut National pour générales Medical Sciences (NIGM) (5605100122001), une composante de la National Institutes of Health (NIH), ainsi que l’Université du Nebraska à Kearney (UNK) Summer Student Research Programme (SSRP) et UNK Bourse de recherche de premier cycle (URF).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
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