Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo
Summary
Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo’s de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.
Abstract
DNA replicatie timing is een belangrijke cellulaire kenmerk, vertonen belangrijke relaties waarbij de structuur van de chromatine, transcriptie en DNA mutatie tarieven. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden tijdens de ontwikkeling en in Kreeft, maar de timing van de replicatie rol speelt bij ontwikkeling en ziekte is niet bekend. Zebravis werden onlangs opgericht als een in vivo modelsysteem te bestuderen van de timing van de replicatie. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van de zebravis om DNA replicatie timing. Na het sorteren van cellen van embryo’s en volwassen zebrafish, kunnen high-resolution genoom-brede DNA replicatie timing patronen worden geconstrueerd door het bepalen van de veranderingen in DNA exemplaaraantal door middel van analyse van de volgende generatie sequencing gegevens. De zebravis modelsysteem zorgt voor evaluatie van de timing replicatiewijzigingen die optreden in vivo in de gehele ontwikkeling, en kan ook worden gebruikt voor het beoordelen van wijzigingen in afzonderlijke celtypes, ziekte modellen of mutant lijnen. Deze methoden bestudering, onderzoek naar de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en onderhoud tijdens de ontwikkeling mogelijk maken, de timing van de replicatie rol speelt in de mutaties en tumorigenesis, en de gevolgen van de storing veroorzaakt de timing van de replicatie op ontwikkeling en ziekte.
Introduction
Voor cellen te verdelen met succes, moeten ze eerst nauwkeurig en getrouw repliceren hun gehele genoom. Genoom dubbel treedt op in een reproduceerbare patroon, bekend als de DNA replicatie timing programma1. DNA replicatie timing is gecorreleerd met de organisatie van de chromatine, epigenetische merken en gene expression2,3. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden in de gehele ontwikkeling, en zijn aanzienlijk aan transcriptionele gerelateerde programma’s en aanpassingen aan de chromatine merken en organisatie4,5. Bovendien, replicatie timing is gecorreleerd met vogelgriepvirus frequenties en veranderingen in de timing zijn waargenomen bij verschillende soorten kanker6,7,8. Ondanks deze opmerkingen, de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en verordening zijn nog grotendeels onbekend, en de rol die het speelt bij ontwikkeling en ziekte is onbepaald. Bovendien, tot onlangs de genoom-brede replicatie had timing van de veranderingen die zich in de gehele gewervelde ontwikkeling voordoen alleen onderzocht in cel cultuur modellen.
Zebravis, Danio rerio, zijn zeer geschikt voor het studeren replicatie timing in vivo tijdens de ontwikkeling, zoals een enkele paring paar kan opleveren van honderden embryo’s die ontwikkelen snel met veel gelijkenissen met zoogdieren ontwikkeling9, 10. Verder zijn er in de gehele ontwikkeling van de zebravis, wijzigingen in de celcyclus, chromatine organisatie en transcriptionele’s die relaties met DNA replicatie timing11delen. Zebravis zijn ook een uitstekende genetische model, zoals ze zijn bijzonder vatbaar voor manipulatie door Transgenese, mutagenese en gerichte mutaties en genetische schermen hebben vele genen nodig zijn voor de ontwikkeling van de gewervelde12geïdentificeerd. Zebrafish kan daarom worden gebruikt om genen die betrokken zijn bij replicatie timing totstandbrenging en het beheer te identificeren en te observeren van de gevolgen van de deregulering van de replicatie timing op gewervelde ontwikkeling. Transgene lijnen kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de timing van de replicatie van afzonderlijke celtypes geïsoleerd op verschillende ontwikkelings timepoints of bij ziekte. Nog belangrijker is, zijn er verschillende zebrafish modellen van ziekten bij de mens die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van replicatie timing in ziekte vorming en progressie9,13,14.
Onlangs, waren de eerste replicatie timing profielen gegenereerd op basis van zebravis, tot vaststelling van het als een modelsysteem om te studeren van replicatie in vivo15timing. Om dit te bereiken, werden cellen verzameld uit zebrafish embryo’s in meerdere stadia van ontwikkeling en in een celtype van volwassen zebrafish geïsoleerd. Cellen werden vervolgens gesorteerd FACS (fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren) op basis van DNA-inhoud te isoleren van de G1 en S fase populaties. Kopiëren met behulp van de G1 voorbeeld als een numeriek besturingselement kopiëren, aantal variaties in de S-fase populaties werden bepaald en gebruikt voor het afleiden van de replicatie van de relatieve timing16. Veranderingen in de timing van de replicatie kunnen vervolgens direct worden vergeleken tussen verschillende ontwikkelings monsters en celtypes en dit werd gebruikt om te bepalen van de veranderingen in de timing van de replicatie die in vivo in gewervelde ontwikkeling optreden. Deze methode biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genomische methoden, vooral dat het niet nodig labelen met thymidine analogen of immunoprecipitation van DNA4,6.
Hier is de protocollen profiel genoom-brede DNA replicatie timing op gedetailleerde hoge resolutie in zebrafish. Deze protocollen zijn gebruikt om de relaties met de genomische en epigenetische functies in het genoom van de zebravis, evenals profilering van veranderingen in deze relaties die zich in de gehele ontwikkeling voordoen bepalen. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aangepast om te bestuderen van de veranderingen in de timing van de replicatie in gemuteerde stammen van zebravis en ziekte modellen. Bovendien bevatten deze methoden een stichting die kan worden uitgebreid om te bestuderen replicatie timing in specifieke celtypen, door de eerste sortering uit de individuele celtypes van de zebravis. De zebravis kan dienen als een uitstekende in-vivo modelsysteem te bestuderen van replicatie timing en uiteindelijk het onthullen van de biologische functies van deze belangrijke epigenetische trek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebravis vormen een nieuwe en unieke in-vivo modelsysteem te bestuderen van DNA replicatie timing. Wanneer getimede verparingen zijn uitgevoerd als beschreven in deze experimentele protocol, duizenden embryo’s kunnen worden verzameld in een enkele dag voor experimenten. Deze embryo’s ontwikkelen synchroon door precies getimed en duidelijk gekenmerkt stadia van ontwikkeling. Zebrafish kan worden gemakkelijk en nauwkeurig enscenering morfologie met een stereomicroscoop, zoals zebrafish embryo’s extern te ontwikkel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health door verleent 5P20GM103636-02 (inclusief Stroom Cytometry core ondersteuning) en 1R01GM121703, evenals awards van de Oklahoma-centrum voor volwassen stamcel Onderzoek.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
Riferimenti
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
