Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo
Summary
Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.
Abstract
Synchronisation de réplication de l’ADN est une caractéristique importante de cellulaire, présentant des relations significatives avec la structure de la chromatine, transcription et taux de mutation de l’ADN. Changements dans le calendrier de réplication se produisent pendant le développement et le cancer, mais la synchronisation de la réplication de rôle joue dans le développement et la maladie ne connaît pas. Poisson zèbre ont été récemment mis en place comme un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de la réplication. Voici détaillée des protocoles permettant d’utiliser le poisson-zèbre pour déterminer le calendrier de réplication de l’ADN. Après le tri des cellules d’embryons et de poisson-zèbre adulte, haute résolution génome ADN réplication calendrier modèles peuvent être construits par la détermination des changements dans le nombre de copies d’ADN grâce à l’analyse des données de séquençage de génération suivante. Le système de modèle zebrafish permet d’évaluer les modifications de calendrier de réplication qui se produire in vivo au cours du développement et peut également être utilisé pour évaluer les changements dans les types de cellules individuelles, les modèles de maladies ou lignées mutantes. Ces méthodes permettront aux études portant sur les mécanismes et les déterminants de la création de synchronisation de la réplication et l’entretien pendant le développement, la synchronisation de la réplication de rôle joue dans les mutations et tumorigenèse et les effets de perturber synchronisation de réplication sur le développement et la maladie.
Introduction
Pour les cellules de diviser avec succès, ils doivent tout d’abord exactement et fidèlement reproduire leur génome entier. Duplication du génome se produit dans un modèle reproductible, appelé l’ADN réplication calendrier programme1. Synchronisation de réplication de l’ADN est en corrélation avec l’organisation de la chromatine, marques épigénétiques et gene expression2,3. Changements dans calendrier de réplication se produisent au cours du développement et sont significativement liés à la transcription des programmes et modifications de la chromatine marques et organisation4,5. En outre, synchronisation de réplication est corrélée avec des fréquences mutationnelles, et on observe des changements dans le calendrier dans divers types de cancer6,7,8. Malgré ces observations, les mécanismes et les déterminants de la création de synchronisation de la réplication et la réglementation sont encore largement inconnus et le rôle qu’elle joue dans le développement et la maladie n’est pas déterminée. En outre, jusqu’à récemment la réplication du génome calendrier des changements qui se produisent tout au long du développement des vertébrés avait seulement été examinée en modèles de culture de cellules.
Poisson-zèbre, Danio rerio, sont bien adaptés pour étudier la réplication calendrier in vivo au cours du développement, tel qu’un seul couple peut donner des centaines d’embryons qui se développent rapidement avec nombreuses similitudes avec le développement mammifère9, 10. En outre, tout au long du développement du poisson zèbre, il y a des changements pour le cycle cellulaire, organisation de la chromatine et transcriptionnelles programmes qui partagent des relations avec la réplication de l’ADN calendrier11. Poisson zèbre est aussi un excellent modèle génétique, car ils se prêtent particulièrement à la manipulation par transgénèse, mutagénèse et mutations ciblées, et écrans génétiques ont identifié de nombreux gènes requis pour le développement des vertébrés12. Par conséquent, poisson zèbre peut être utilisé pour identifier les gènes impliqués dans l’entretien et la création de synchronisation de réplication et d’observer les effets de la déréglementation “timing” réplication sur du développement des vertébrés. Les lignées transgéniques permet également d’évaluer la synchronisation de la réplication de types de cellules individuelles isolées à différents points du développement ou dans des conditions de maladie. Ce qui est important, il existe divers modèles de poisson-zèbre de maladie humaine qui peut être utilisé pour étudier le rôle de la synchronisation de la réplication en maladie la formation et la progression9,13,14.
Récemment, les profils de synchronisation de réplication premières proviennent du poisson-zèbre, établissant comme un système modèle pour étudier la réplication calendrier in vivo15. Pour ce faire, les cellules ont été prélevés des embryons de poisson-zèbre à plusieurs étapes de développement et dans un type de cellule isolée du poisson-zèbre adulte. Les cellules ont été ensuite triés par FACS (fluorescence-lancée de cellules tri) basée sur la teneur en ADN pour isoler des populations de phase G1 et S. Utilisez l’exemple de G1 comme un contrôle de nombre de copie, copie numéros variations dans les populations de phase S ont été déterminées et utilisées pour déduire la synchronisation de réplication relative16. Changements dans calendrier de réplication peuvent être directement comparés entre les différents échantillons de perfectionnement et de types de cellules, et cela a servi à déterminer au moment de la réplication des changements qui se produisent en vivo tout au long du développement des vertébrés. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes de la génomique, surtout qu’il ne nécessite pas d’étiquetage avec les analogues de la thymidine ou immunoprécipitation d’ADN4,6.
Voici détaillées les protocoles au point de la réplication de l’ADN profil Génome-large à haute résolution chez le poisson zèbre. Ces protocoles ont été utilisés pour déterminer les relations avec les caractéristiques génomiques et épigénétiques dans le génome du poisson-zèbre, ainsi que des changements dans ces relations qui se produisent au cours du développement de profilage. Ces protocoles sont également facilement adaptés pour étudier les changements dans le calendrier de réplication chez les souches mutantes de poisson-zèbre et dans des modèles de la maladie. En outre, ces méthodes fournissent une base qui peut être étendue à d’étudier le calendrier de réplication dans les cellules spécifiques, par un premier tri sur les types de cellules individuelles du poisson-zèbre. Le poisson-zèbre peut servir comme un excellent en vivo système modèle pour étudier la synchronisation de la réplication et de révéler au bout du compte les fonctions biologiques de ce caractère épigénétique important.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poisson zèbre fournissent un système de modèle nouveau et unique le in vivo pour étudier la synchronisation de réplication de l’ADN. Quand chronométrés croisements sont effectués comme détaillé dans le présent protocole expérimental, des milliers d’embryons peuvent être rassemblées en une seule journée pour des expériences. Ces embryons se développent de façon synchrone par précisément chronométrés et nettement caractérisées des stades de développement. Poisson zèbre peut être faci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par National Institute of General Medical Sciences de la National Institutes of Health à travers accorde 5P20GM103636-02 (avec le support de base Flow Cytometry) et 1R01GM121703, ainsi que des prix depuis le centre de l’Oklahoma pour les cellules souches adultes Recherche.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
Riferimenti
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