डीएनए प्रतिकृति एक Vivo में मॉडल प्रणाली के रूप में Zebrafish का उपयोग समय की रूपरेखा
Summary
Zebrafish हाल ही में एक vivo मॉडल प्रणाली में विकास के दौरान डीएनए प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के रूप में इस्तेमाल किया गया । यहां प्रोफ़ाइल प्रतिकृति समय zebrafish भ्रूण का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से म्यूटेंट, व्यक्तिगत कोशिका प्रकार, रोग मॉडल, और अंय प्रजातियों में पुनरावृत्ति समय का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Abstract
डीएनए प्रतिकृति समय एक महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषता है, क्रोमेटिन संरचना, प्रतिलेखन, और डीएनए उत्परिवर्तन दरों के साथ महत्वपूर्ण संबंधों का प्रदर्शन । परिवर्तन प्रतिकृति समय में विकास और कैंसर के दौरान हो, लेकिन भूमिका प्रतिकृति समय में विकास और रोग ज्ञात नहीं है निभाता है । Zebrafish हाल ही में एक vivo मॉडल सिस्टम में प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के रूप में स्थापित किया गया । डीएनए प्रतिकृति समय निर्धारित करने के लिए zebrafish का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत है । भ्रूण और वयस्क zebrafish से कोशिकाओं छंटाई के बाद, उच्च संकल्प जीनोम चौड़ा डीएनए प्रतिकृति समय पैटर्न अगली पीढ़ी sequencing डेटा के विश्लेषण के माध्यम से डीएनए कॉपी संख्या में परिवर्तन का निर्धारण करके निर्माण किया जा सकता है । zebrafish मॉडल प्रणाली के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है प्रतिकृति समय परिवर्तन है कि विकास के दौरान vivo में होते हैं, और भी व्यक्तिगत कोशिका प्रकार, रोग मॉडल, या उत्परिवर्ती लाइनों में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन पद्धतियों प्रणाली और प्रतिकृति समय स्थापना और रखरखाव के निर्धारकों के विकास के दौरान, भूमिका प्रतिकृति समय उत्परिवर्तनों और tumorigenesis में खेलता है, और perturbing के प्रभाव की जांच के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा विकास और रोग पर पुनरावृत्ति समय ।
Introduction
कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विभाजित करने के लिए, वे पहले सही और ईमानदारी से अपने पूरे जीनोम दोहराने चाहिए । जीनोम दोहराव एक reproducible पैटर्न, डीएनए प्रतिकृति समय कार्यक्रम के रूप में जाना जाता है1में होता है । डीएनए प्रतिकृति समय क्रोमेटिन संगठन, epigenetic चिह्न, और जीन अभिव्यक्ति2,3के साथ संबंधित है । प्रतिकृति समय में परिवर्तन विकास भर में होते हैं, और काफी transcriptional प्रोग्राम और परिवर्तन करने के लिए क्रोमेटिन चिह्न और संगठन4,5से संबंधित हैं । इसके अलावा, प्रतिकृति समय उत्परिवर्तन आवृत्तियों के साथ संबंधित है, और समय में परिवर्तन कैंसर6,7,8के विभिंन प्रकार में मनाया जाता है । इन टिप्पणियों के बावजूद, तंत्र और प्रतिकृति समय स्थापना और विनियमन के निर्धारकों अभी भी काफी हद तक अनजान हैं, और भूमिका यह विकास और रोग में खेलता है अनिर्धारित है । इसके अलावा, हाल ही में जब तक जीनोम चौड़ा प्रतिकृति समय परिवर्तन हड्डीवाला विकास भर में होते है केवल सेल संस्कृति मॉडल में जांच की गई थी ।
Zebrafish, ढाणियो rerio, अच्छी तरह से विकास के दौरान vivo में प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं, एक एकल संभोग जोड़ी के रूप में कई समानताएं के साथ तेजी से विकसित करने वाले भ्रूण के सैकड़ों की उपज कर सकते है स्तनधारी विकास9, 10. इसके अलावा, zebrafish के पूरे विकास में, कोशिका चक्र, क्रोमेटिन संगठन और transcriptional प्रोग्राम में परिवर्तन होते हैं, जो डीएनए प्रतिकृति के साथ संबंध साझा करते हैं11. Zebrafish भी एक उत्कृष्ट आनुवंशिक मॉडल हैं, क्योंकि वे विशेष रूप से transgenesis, mutagenesis द्वारा हेरफेर के लिए उत्तरदाई हैं, और लक्षित उत्परिवर्तनों, और आनुवंशिक स्क्रीन कई हड्डीवाला विकास के लिए आवश्यक जीन की पहचान की है12। इसलिए, zebrafish प्रतिकृति समय स्थापना और रखरखाव में शामिल जीन की पहचान करने के लिए और हड्डीवाला विकास पर प्रतिकृति समय को विनियमित करने के प्रभावों का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ट्रांसजेनिक रेखाओं का उपयोग अलग विकासात्मक timepoints या रोग स्थितियों में पृथक कक्ष प्रकारों से पुनरावृत्ति समय का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, वहां मानव रोग के विभिंन zebrafish मॉडल है कि रोग के गठन और प्रगति9,13,14में प्रतिकृति समय की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हाल ही में, पहली प्रतिकृति समय प्रोफ़ाइल zebrafish से जनरेट किया गया, यह एक मॉडल सिस्टम vivo मेंप्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए के रूप में स्थापित कर रहा है15. यह पूरा करने के लिए, कोशिकाओं zebrafish भ्रूण से विकास के कई चरणों में और एक वयस्क zebrafish से पृथक कक्ष प्रकार में एकत्र किए गए । सेल तो FACS (प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई) द्वारा डीएनए सामग्री के आधार पर G1 और एस चरण की आबादी को अलग करने के लिए क्रमबद्ध थे । एक प्रतिलिपि संख्या नियंत्रण के रूप में G1 नमूना का उपयोग करना, एस चरण आबादियों में संख्या भिंनता की प्रतिलिपि निर्धारित किया गया था और संबंधित प्रतिकृति समय16का अनुमान है । प्रतिकृति समय में परिवर्तन फिर सीधे विभिंन विकासात्मक नमूनों और कक्ष प्रकारों के बीच तुलना की जा सकती है और यह हड्डीवाला पूरे विकास में vivo में होने वाली प्रतिकृति समय में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया था । इस विधि अंय जीनोमिक तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है, मुख्य रूप से है कि यह thymidine अनुरूप या डीएनए4,6के immunoprecipitation के साथ लेबल की आवश्यकता नहीं है ।
यहां zebrafish में उच्च संकल्प प्रोफ़ाइल जीनोम चौड़ा डीएनए प्रतिकृति समय के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत है । इन प्रोटोकॉल zebrafish जीनोम में जीनोमिक और epigenetic सुविधाओं के साथ संबंधों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही विकास के दौरान होने वाले इन संबंधों में परिवर्तन की रूपरेखा । इन प्रोटोकॉल भी आसानी से zebrafish के उत्परिवर्ती उपभेदों और रोग मॉडल में प्रतिकृति समय में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । साथ ही, इन पद्धतियों एक नींव है कि विशिष्ट कक्ष प्रकारों में प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए पर विस्तार किया जा सकता प्रदान करते हैं, पहले बाहर zebrafish से अलग कक्ष प्रकार छंटाई । zebrafish में एक उत्कृष्ट के रूप में सेवा कर सकते हैं vivo मॉडल सिस्टम प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए और अंत में इस महत्वपूर्ण epigenetic विशेषता के जैविक कार्यों को प्रकट करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish एक नया और अद्वितीय vivo मॉडल प्रणाली में डीएनए प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए प्रदान करते हैं । जब समय पर सहवास इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं, भ्रूण के हजार?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल चिकित्सा विज्ञान के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा अनुदान 5P20GM103636 के माध्यम से समर्थित किया गया था-02 (प्रवाह Cytometry कोर समर्थन सहित) और 1R01GM121703, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क स्टेम सेल के लिए ओकलाहोमा सेंटर से पुरस्कार अनुसंधान.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
Riferimenti
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
