Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы
Summary
Данио рерио недавно использовались как в естественных условиях система моделей для изучения времени репликации ДНК в процессе разработки. Вот подробные протоколы для использования данио рерио эмбрионов для синхронизации репликации профилей. Этот протокол может быть легко адаптирована для изучения времени репликации в мутантов, типы отдельных клеток, болезни моделей и других видов.
Abstract
Синхронизация репликации ДНК является важной характеристикой сотовой, экспонирование существенные отношения с Структура хроматина, транскрипция и скорости мутации ДНК. Изменения в сроках репликации происходят во время разработки и в рак, но времени репликации роль играет в развитии и заболевания не известна. Данио рерио недавно были созданы как в естественных условиях модель системы для изучения времени репликации. Вот подробные протоколы для использования данио рерио для определения сроков репликации ДНК. После сортировки клеток эмбрионов и взрослых рыбок данио, могут быть построены с высоким разрешением шаблоны времени репликации ДНК генома общесистемной путем определения изменений в ДНК копировать количество путем анализа последовательности данных следующего поколения. Данио рерио модель системы позволяет для оценки изменений времени репликации, которые происходят в естественных условиях на протяжении развития и может также использоваться для оценки изменений в типы отдельных клеток, модели заболеванием или мутантных линий. Эти методы позволят исследования, изучение механизмов и детерминанты репликации сроков создания и обслуживания во время разработки, сроки репликации роль играет в мутации и tumorigenesis и последствия нарушается время репликации по развитию и болезни.
Introduction
Для клетки к делению успешно они должны сначала точно и добросовестно повторить их весь геном. Геном дублирования в шаблоне воспроизводимость, известный как ДНК репликации сроки программы1. Синхронизация репликации ДНК соотносится с организации хроматина, эпигенетических меток и ген выражение2,3. Изменения в сроках репликации происходят на протяжении всего развития и значительно, относящиеся к транскрипционный анализ программ и изменения знаков хроматина и организации4,5. Кроме того репликация сроков связан с мутационного частот, и изменения в сроках наблюдаются в различных видах рака6,,78. Несмотря на эти замечания механизмы и факторы репликации сроков создания и регулирования по-прежнему в основном неизвестны и роль он играет в развитии и болезнь является неопределенным. Кроме того до недавно генома репликацией времени изменения, которые происходят на протяжении всего развития позвоночных только были изучены в модели культуры клеток.
Данио рерио, данио рерио, хорошо подходят для изучения репликации сроков в vivo во время разработки, как брачные пары может принести сотни эмбрионов, которые развиваются быстро с много сходства с млекопитающих развития9, 10. Кроме того на протяжении развития данио рерио, есть изменения клеточного цикла, организации хроматина и transcriptional программы, использующие отношения с ДНК репликации времени11. Данио рерио являются также отличным генетическим модели, как они особенно поддаются манипуляции трансгенез, мутагенеза и целевых мутации, и генетические экраны определили многих генов, необходимых для развития позвоночных12. Таким образом данио рерио может использоваться для идентификации генов, участвующих в репликации сроков создания и обслуживания и наблюдать последствия дерегулирования времени репликации на позвоночных развития. Трансгенные линии может также использоваться для оценки времени репликации из типов клеток отдельных, изолированных в различные области развития timepoints, или в условиях заболевания. Важно отметить, что существуют различные модели данио рерио болезней человека, который может использоваться для изучения роли репликации сроков в болезни формирования и прогрессии9,,1314.
Недавно первый профили синхронизации репликации были получены от данио рерио, утвердив его в качестве модельной системы для изучения времени в vivo15репликации. Для этого, клетки были собраны от zebrafish эмбриона на нескольких стадиях развития и в типе ячейки, изолированных от взрослых рыбок данио. Клетки были затем сортируются по СУИМ (сортировки активирован флуоресценции клеток) на основе содержимого ДНК для изоляции населения фазы G1 и S. Используя пример G1 как элемент номер копии, скопируйте номер вариации в S-фазе населения были определены и используются для определения относительной репликации времени16. Изменения в сроках репликации можно непосредственно сравнить между различными развития образцов и типов клеток, и это было использовано для определения изменения в репликации сроков, которые происходят в естественных условиях на протяжении развития позвоночных. Этот метод предлагает несколько преимуществ над другими геномной методами, главным образом что оно не требует маркировки с тимидина аналогов или иммунопреципитации ДНК4,6.
Вот подробные протоколы к профиль ДНК генома общесистемной репликации сроков на высокого разрешения в данио рерио. Эти протоколы были использованы для определения отношения с геномных и эпигенетических функций в геноме данио рерио, а также профилировать изменения в этих отношениях, которые происходят на протяжении всего развития. Эти протоколы являются также легко адаптируется к изучать изменения в сроках репликации в мутантных штаммов данио рерио и модели заболеванием. Кроме того эти методы предоставляют основу, которая может быть расширена после изучения времени репликации в типах конкретных клеток, сортируя первый из типов индивидуальных клеток от данио рерио. Данио рерио может служить отличным в vivo модель системы для изучения времени репликации и в конечном итоге выявить биологические функции этой важной чертой эпигеномные.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио рерио предоставляют новый и уникальный в естественных условиях модельной системы для изучения времени репликации ДНК. Когда приурочен вязки выполняются как подробно этот экспериментальный протокол, тысячи эмбрионы могут быть собраны в один день для экспериментов. Эти эмбр…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здравоохранения посредством грантов 5P20GM103636-02 (включая поддержку основной поток цитометрии) и 1R01GM121703, а также награды от Оклахома центр для взрослых стволовых клеток Исследования.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
Riferimenti
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
