Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo
Summary
Pez cebra han utilizado recientemente como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación del ADN durante el desarrollo. Aquí está detallada de los protocolos para el uso de embriones de pez cebra para sincronización de replicación de perfil. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de la sincronización de replicación en mutantes, tipos de células individuales, modelos de la enfermedad y otras especies.
Abstract
Sincronización de replicación de ADN es una característica celular importante, exhibiendo las relaciones significativas con tasas de mutación de ADN, la transcripción y la estructura de la cromatina. Cambios en la sincronización de replicación se producen durante el desarrollo y en el cáncer, pero la sincronización de replicación de papel desempeña en el desarrollo y la enfermedad no se conoce. Pez cebra recientemente se establecieron como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación. Aquí está detallada de los protocolos mediante el pez cebra para determinar tiempo de replicación de ADN. Después de clasificar las células de embriones y pez cebra adulto, alta resolución genoma ADN replicación sincronización los patrones pueden construirse mediante la determinación de cambios en el número de copias de ADN a través del análisis de datos de secuenciación de próxima generación. El sistema de modelo de pez cebra permite la evaluación de los cambios de sincronización de replicación que se presentan en vivo en todo el desarrollo y también puede utilizarse para evaluar los cambios en tipos de células individuales, modelos de la enfermedad o las líneas mutantes. Estos métodos le permitirá investigar los mecanismos y determinantes de la replicación sincronización establecimiento y mantenimiento durante el desarrollo de los estudios, la sincronización de replicación de papel desempeña en mutaciones y tumorigenesis y los efectos de perturbar sincronización de replicación en el desarrollo y la enfermedad.
Introduction
Para que las células dividir con éxito, debe en primer lugar con precisión y fielmente replican su genoma completo. Duplicación del genoma ocurre en un patrón reproducible, conocido como ADN replicación sincronización programa1. Sincronización de replicación del ADN se correlaciona con la organización de la cromatina, las marcas epigenéticas y gene expression2,3. Cambios en la sincronización de replicación se producen en todo el desarrollo y son programas relacionados significativamente conexos transcripcional y alteraciones en la cromatina marcas y organización4,5. Además, sincronización de replicación se correlaciona con frecuencias mutacionales, y cambios en el momento se observan en varios tipos de cáncer6,7,8. A pesar de estas observaciones, los mecanismos y determinantes de la regulación y establecimiento de tiempos de replicación son todavía en gran parte desconocidos y el papel desempeña en el desarrollo y la enfermedad es indeterminada. Además, hasta hace poco la replicación del genoma sincronización los cambios que ocurren a lo largo del desarrollo de vertebrados sólo se examinó en modelos de cultivo celular.
Pez cebra, Danio rerio, son adecuados para el estudio de replicación sincronización en vivo durante el desarrollo, como un solo par de acoplamiento puede producir cientos de embriones que se desarrollan rápidamente con muchas similitudes al desarrollo mamífero9, 10. Además, a lo largo del desarrollo del pez cebra, hay cambios en el ciclo celular, organización de la cromatina y programas transcripcionales que comparten relaciones de sincronización de replicación de ADN11. Pez cebra también son un excelente modelo genético, ya que son particularmente susceptibles a la manipulación por transgénesis, mutagénesis y mutaciones dirigidas y pantallas genéticas han identificado muchos genes necesarios para el desarrollo de vertebrados12. Por lo tanto, pez cebra puede utilizarse para identificar genes implicados en el mantenimiento y establecimiento de tiempos de replicación y observar los efectos de la desregulación de sincronización de replicación en el desarrollo de vertebrados. Líneas transgénicas pueden utilizarse también para evaluar la sincronización de replicación de tipos de células individuales aisladas en diferentes puntos de tiempo del desarrollo o en condiciones de enfermedad. Lo importante, hay varios modelos de pez cebra de la enfermedad humana que puede utilizarse para investigar la función de sincronización de replicación en enfermedad formación y progresión9,13,14.
Recientemente, se obtuvieron los perfiles de sincronización de replicación primera de pez cebra, estableciendo como sistema modelo para estudiar la replicación sincronización en vivo15. Para lograr esto, se obtuvieron células de embriones de pez cebra en varias etapas de desarrollo y en un tipo de células aisladas de pez cebra adulto. Las células fueron después ordenadas por FACS (clasificación celular activado por fluorescencia) basado en el contenido de DNA para aislar a poblaciones de fase G1 y S. Usando la muestra G1 como un control de número de copia, copia número variaciones en las poblaciones de fase S eran determinadas y deducir replicación relativo tiempo16. Cambios en la sincronización de replicación entonces se pueden comparar directamente entre diferentes muestras de desarrollo y tipos de la célula y esto fue utilizada para determinar cambios en la sincronización de replicación que se producen en vivo a lo largo del desarrollo de vertebrados. Este método ofrece varias ventajas sobre otros métodos genómicos, principalmente que no requiere de etiquetado con análogos de la timidina o inmunoprecipitación de ADN4,6.
Aquí está detallada de los protocolos de sincronización de replicación de ADN perfil genoma en alta resolución en el pez cebra. Estos protocolos se han utilizado para determinar las relaciones con las características genómicas y epigenéticas en el genoma del pez cebra, así como cambios en estas relaciones que se producen en todo el desarrollo de perfiles. Estos protocolos se adaptan fácilmente para estudiar cambios en la sincronización de replicación en cepas mutantes de pez cebra y en modelos de la enfermedad. Además, estos métodos proporcionan una base que puede ser ampliada a estudiar sincronización de replicación en tipos celulares específicos, primero clasificar los tipos de la célula individual del pez cebra. El pez cebra puede servir como un excelente en vivo sistema modelo para estudiar el tiempo de replicación y finalmente revelar las funciones biológicas de este importante rasgo de la epigenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pez cebra proporcionan un sistema de modelo nuevo y único en vivo para el estudio de sincronización de replicación de ADN. Cuando se realizan cruzamientos programados como detallado en este protocolo experimental, miles de embriones pueden ser colectados en un solo día para experimentos. Estos embriones se desarrollan sincrónicamente precisamente tiempo y claramente caracterizado etapas de desarrollo. Pez cebra puede ser fácil y precisa puesta en escena por morfología mediante un estereomicroscopio, como …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud a través de becas 5P20GM103636-02 (incluyendo soporte de base de citometría de flujo) y 1R01GM121703, así como los premios desde el centro de Oklahoma para la células madre adultas Investigación.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
Riferimenti
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).
- Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
