Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Summary

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica altamente reprodutível para avaliação na vivo do rompimento da barreira hemato – encefálica em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

Abstract

Acidente vascular cerebral isquêmico leva a edema cerebral vasogénico e lesões cerebrais primários posteriores, que é mediada através da destruição da barreira hemato – encefálica (BBB). Ratos com isquemia induzida foram estabelecidos e usados como modelos na vivo para investigar a integridade funcional do BBB. Detecção espectrofotométrica de azul de Evans (EB) em amostras de cérebro com lesão isquêmica poderia fornecer uma justificação confiável para pesquisa e desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas. Esse método gera resultados reprodutíveis e é aplicável em qualquer laboratório sem a necessidade de equipamento especial. Aqui, apresentamos uma orientação técnica e visualizada na detecção do extravasamento de EB após indução de acidente vascular cerebral isquêmico em ratos.

Introduction

Edema cerebral de vasogénico devido ao rompimento da barreira hemato – encefálica (BBB) continua a ser uma complicação importante do acidente vascular cerebral isquêmico e um importante determinante da taxa de sobrevivência no curso pacientes^1,2. A barreira hemato – encefálica (BBB), que é formada por células endoteliais capilares do cérebro (BCECs) e composta por componentes neurovascular distintas (por exemplo, apertado junções entre células neuronais³, pericitos, Ralevic e BCECs), fornece uma especializados e dinâmica interface entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulação do sangue periférico-^4,5. Insultos, tais como lesões de isquémia-reperfusão poderiam perturbar a integridade funcional do BBB e conduzir a penetração posterior de leucócitos em circulação para o parênquima cerebral que em última análise, provocam inflamação cerebral e lesões cerebrais primários ^{6 , 7}. modelos animais são necessários para a detecção exata da disfunção do BBB após ocorrência de um acidente vascular cerebral. Tais modelos são de grande importância para o estudo subjacente mecanismos fisiopatológicos e introdução de novas estratégias de neuroprotetor. Em vitro celular cultura baseado em modelos do BBB foram altamente desenvolvidos e utilizados para o estudo molecular do BBB fisiopatologia^8,9,10. No entanto, na vivo modelos animais, que produzem danos isquêmicos do BBB semelhante ao humanas condições clínicas, também são muito interessante a este respeito. A detecção quantitativa do extravasamento de azul de Evans (EB) é uma técnica bem aceita e sensível que tem sido utilizada para avaliação da integridade do BBB e função em doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular cerebral isquêmico^{11, 12 , 13 , 14}. este método é cost-effective, viável, reprodutível e totalmente aplicável em qualquer laboratório experimental. Sua implementação não requer equipamentos avançados, tais como traçadores radioativos¹⁵ ou ressonância magnética (MRI)¹⁶, que são pré-requisitos para outros métodos. Neste artigo, demonstramos exaustivamente processos básicos de técnicos de avaliação de BBB usando o extravasamento de EB em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes da Ardabil University of Medical Sciences Research Council, para a realização de estudos com animais (número de identificação ética: ir JARROS. REC.1394.08). neste estudo visualizado, usamos ratos macho adulto Sprague-Dawley (300-350 g) obtidos de pastagem Institute (Teerã, Irã). 1. anestesia e Flowmetry Induzir a anestesia usando 4% de isoflurano e mantê-lo com isoflurano (1-1,5%) em uma mistura de ó…

Representative Results

Não houve diferença significativa nos níveis EB no hemisfério direito vs hemisfério esquerdo dos ratos operação (1,06 ± 0,1 µ g/g e 1,1 ± 0,09 µ g/g, respectivamente). Conforme mostrado nas figuras 2A-2B, indução de isquemia transitória (90 min isquemia / reperfusão 24h) causou uma diferença significativa nos níveis de EB (10,41 ± 0,84 µ g/g, p < 0,001) no hemisfério esquerdo de ratos isquêmicos, em comparação com os respectivos Hemisfério…

Discussion

Até agora, vários métodos como autoradiografia e detecção dos traçadores radioativos^24,25, microscopia de imunofluorescência^26,27, EB extravasamento técnica^20, e ²³ têm sido utilizados para avaliar o dano da barreira hemato – encefálica. Tintura EB é fortemente podem ligar para a albumina e é usada como um marcador para detectar vazame…

Materials

Isoflurane	Piramal	AWN 34041100	20 – 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Molekula	31216368	4 years
Sprague–Dawley rats	Pasture Institute (Tehran, Iran)		300-350g
Evans Blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 years
Bupivacaine HCl (0.5%)	Delpharm Tours		below  25 °C
Bupernorphine	Exir (Iran)
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	497-19-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate	EMD Millipore	231-448-7
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universal plus	Heraeus	66037445
Micro-Dissecting forceps	Stoelting	52100-41
Spring Scisors	Stoelting	52130-00
Operating  Scissors	Roboz	52140-70
Brain matrix	Stoelting	51390
Anesthesia Machine for Small Animals |	Kent Scientific	SS-01
Power Lab system	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Heating feed back system	Harvard Appratus	72-7560
Vascular micro clamp	FineScience Tools	18055-03
Silk 5-0 suture thread	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 suture thread	Ethicon	EH6740G