En metod för ötransplantation till Omentum i musen
Summary
En metod för omental transplantation av holmar i en mus introduceras. De isolera öarna är blandade med hydrogel och blandningen placeras i omental påsen diabetiker musklick. Sedan blodglukosnivån övervakas och immuno-histochemical analysen utförs.
Abstract
Ö-transplantation har föreslagits vara en potentiell behandling för typ 1-diabetes. Senaste tvingande bevis indikerar att intravaskulär holme infusion är långt ifrån idealisk och omentum är därför åter framväxande som en potentiellt värdefulla plats för ö-transplantation. Detta experiment kräver isolering av hög kvalitet holmar och implantation av kobbar och skär till diabetiker mottagarna. Transplantation till omentum kräver kirurgiska åtgärder som kan demonstreras bättre visuellt. Här presenteras de detaljerade anvisningarna för detta förfarande. Två metoder för att blanda de isolera öarna med hydrogel innan placera blandningen i den omental påsen av diabetiska möss beskrivs här. Olika hydrogeler används för olika förhållanden. Blodsockernivåer av diabetiker mus mottagare av syngena holmar i omentum övervakades för upp till 35 dagar. Vissa djur offrades efter 14 dagar att utföra immuno-histochemical analys. Detta prekliniska transplantation tillvägagångssätt kan användas som preliminära uppgifter fram till översättning till kliniska transplantationer.
Introduction
Enligt International Diabetes Federation (IDF), drabbar diabetes mellitus för närvarande 382 miljoner människor, med en väntas öka till 592 miljoner människor av 20351. I både allogen och xenogena ötransplantation är systemisk immunsuppressiv behandling nödvändig. Utan immunsuppression är immun avslag en viktig orsak till transplantat förlust2. Det finns också ett betydande problem för transplanterade holme förlust på grund av den omedelbara blod medierad inflammatorisk reaktion (IBMIR)3,4. Dock även i avsaknad av ett immunsvar som i syngena eller auto-transplantation modeller, cellöar transplanteras i levern via portalen ven går förlorade på grund av inflammation och/eller ogynnsamma miljöförhållanden, såsom dålig blod förse med nedsatt syresättning och/eller näringsämnen5,6. Som ett resultat, för att säkerställa långsiktig metabolisk funktion, är högre holme siffror nödvändigt att kompensera för den ursprungliga cellförlust som minskar engraftment7.
I ett försök att optimera holme engraftment, flera alternativa anatomiska platser har undersökts experimentellt samt kliniskt, med lovande, ännu inte slutgiltiga resultat8. Medan några av de alternativa webbplatserna erbjuder enkel och säker tillgång (t.ex., hud, njurar kapsel, gastric submucosa och främre kammaren i ögat) eller en bredare yta för större holme samlas (t.ex., bukhålan), överlevnad och fysiologiska metaboliska prestanda av de transplanterade holmarna är fortfarande begränsad och förbli en oro9. Sökandet efter en mer lämplig plats för holme engraftment pågår.
Omentum var bland de många anatomiska platser som utreddes i den tidiga utvecklingen av ötransplantation, och visade sig vara en framgångsrik miljö för holmar10,11,12,13, 14. Dock intraportal holme infusion blev med kliniska val beror delvis till den relativa enkelheten i förfarandet och tidig framgång i djur modeller6. Dessutom delvis negativ associerade med denna webbplats, särskilt massiva tidig holme förlust, var mindre förstås och mindre begränsande i början av experimentella ötransplantation som fältet mognat. Med nyare övertygande bevis som indikerar att intravaskulär holme infusion är långt ifrån perfekt, omentum är åter framväxande som en potentiellt värdefulla plats för stamcellstransplantation.
Omentum (i form av en omental påse) erbjuder relativa fördelar jämfört med de lever15,16. Det är välutvecklad simblåsa och lättillgängligt. Det tillåter hämtning av transplantat (om nödvändigt) eller biopsi. Perioden ischemisk upplevs av holmarna minskas jämfört med levern, och omentum kan acceptera relativt stor holme massorna vilket inte är möjligt intraportally, där portalen tryckökning kan orsaka komplikationer.
En syngena musmodell av transplantation användes i det protokoll som testades i studien, anställa C57BL/6 hanmöss mellan 6 – 8 veckor gammal med en kroppsvikt på 20 – 25 g. Islet mottagare var utförda diabetiker med en enda injektion av streptozotocin med en dos på 250 mg/kg ip. Induktion av diabetes kan anses framgångsrik om blodglukosnivån musen är större än 24 mmol/L 48 h efter injektion och förblir över denna nivå i minst 5 dagar.
Syngena holmar var isolerade från bukspottkörteln åldersmatchade givare följande tidigare publicerade metoder med några ändringar. I korthet injicerades kollagenas i gallblåsan istället för gallgången. Detta gjordes som en förbättring att underlätta användarvänlighet injektion. Kollagenas infusion var följt av inkubation, vävnad störningar, täthet lutning separation och handplocka att få ren holmar. Holmar odlades över natten i CMRL-1066 medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) i T175 kolvar vid 37 ° C, under 95% luft – 5% CO2 före transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ö-transplantation till levern via portalen ven är den vanligaste metoden av ötransplantation hos människor, men det finns fortfarande effektivitet och säkerhet oro såsom portalen ven trombos och levern steatos17. Nyligen genomförda studier visar att omentum kan vara ett lämpligt alternativ till levern, men mer forskning behöver göras innan kliniska översättning12,14,18,<sup class="x…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Några av författarna till detta arbete var stöds delvis genom bidrag från nationella tangenten R & D Program i Kina (2017YFC1103704), Sanming Project i medicin i Shenzhen (SZSM201412020), fonden för hög nivå medicinsk disciplin konstruktion av Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation för vetenskap och teknik (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen grunden för hälsa och familjeplanering kommissionen (SZXJ2017021).
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
Riferimenti
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211 (2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364 (2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017 (2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
