מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

Summary

נוגדנים לאגד היעד הקולטנים על פני השטח של התא יכול להתייעץ קונפורמציה והשינויים קיבוץ באשכולות. שינויים דינמיים אלה יש השלכות על אפיון פיתוח תרופות בתאי המטרה. פרוטוקול זה מנצל מיקרוסקופיה קונפוקלית וספקטרוסקופיה של המתאם תמונה דרך ImageJ/פיג’י לכמת את מידת קולטן קיבוץ באשכולות על פני התא.

Abstract

מיקרוסקופיה קונפוקלית מספק מתודולוגיה נגיש כדי ללכוד אינטראקציות סלולרי תת קריטי אפיון ופיתוח נוסף של ניסויים פרה-קליניים סוכנים המסומנת הגששים פלורסנט. עם הפיתוחים האחרונים בתחום תרופות ציטוטוקסיות נוגדן מבוסס מערכות אספקה, הבנה התיקונים. הנגרמת על ידי סוכנים אלה בגדר של צבירת קולטן, הפנמה יש חשיבות קריטית. פרוטוקול זה ממנף את המתודולוגיה ומבוססת של immunocytochemistry פלורסנט והפצה קוד פתוח פיג’י של ImageJ, עם autocorrelation מובנה, פונקציות מתמטיות תמונה, כדי לבצע קורלציה מרחבית תמונה ספקטרוסקופיה (ICS). פרוטוקול זה quantitates את עוצמת פלורסנט של קולטני שכותרתו כפונקציה של אזור קרן של מיקרוסקופ קונפוקלי. זה מספק מדד כמותי של מצב צבירה מולקולת המטרה על פני התא. מתודולוגיה זו מתמקדת האפיון של תאים סטטי עם פוטנציאל להתרחב חקירות הטמפורלי של קולטן מצבור. פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה נגיש לספק כימות של קיבוץ באשכולות אירועים המתרחשים על פני התא, ניצול טוב הוקמה ללא-התמחות מכשיר הדמיה וטכניקות.

Introduction

התפתחות נוגדנים טיפולית הראו הצלחה בטיפול של הגידול במספר סוגים¹. הפיתוחים האחרונים של נוגדן תרופתיים conjugates (ADC) כמו מנגנוני מסירה עבור תרכובות ציטוטוקסיות הרחיבה את הדרישות להבנת הדינמיקה של אינטראקציות נוגדן: קולטן בתא פני השטח². בעקבות מיקוד מוצלחת של נוגדנים לקולטן פני שטח התא, קומפלקסים אלה יכול לגרום דפוסים צבירת דומים לאלה הנהוגות ליגנד: נוגדן אינטראקציות³. שינויים קולטן צבירת יכול לגרום שינויים ממברנה תוצאה ההפנמה של הקולטן והסרה שלו מפני השטח של התא. בהקשר של המספר המשלים נוגדן-סמים, תהליך זה לאחר מכן משחרר את המטען ציטוטוקסיות לתוך endosomes למביטה ובעקבות כך הציטופלסמה, וכתוצאה מכך היעילה תא ההרג.

מיקרוסקופיה קונפוקלית סיפק אמצעי יעיל להמחיש אינטראקציות חשובות אלה של נוגדנים, קולטנים שלהם יעד⁴. כדי לחקור את השינויים של צבירה של מולקולת המטרה על פני התא פרוטוקול זה מנצל לאחר העיבוד של מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות באמצעות תמונות מרחבי המתאם ספקטרוסקופיה (ICS) טכניקה ^5,6,7 .

הקרן של התמונה המתאם ספקטרוסקופיה היא התצפית כי תנודות עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרחבי לשתף יחסים למצב שבו צפיפות, צבירה של המבנים שכותרתו. מערכת היחסים הזו היא הוקמה בעקבות החישוב של פונקציה autocorrelation המרחבי של התמונה שנתפסו⁵.

כל הווריאציות של התמונה המתאם ספקטרוסקופיה דורשים חישוב autocorrelation התמונה. זה ואחריו התאמת פונקציה זו לעקומה גאוסיאנית דו-ממדית על החילוץ של פרמטרים מצב צבירה כמותית הכלול בתוך התמונה. במילים פשוטות החישוב של autocorrelation תמונה כרוך השוואת כל זוגות פיקסל אפשרי בתוך תמונה וחישוב את הסבירות כי שניהם באותה מידה בהיר כמו אחד את השני. זה הוא מדמיין פונקציה של המרחק ואת הכיוונים של פיקסל ההפרדה⁸.

המסגרת התיאורטית ספקטרוסקופיה המתאם התמונה הוקמה ומוגדר על-ידי פיטרסון, ויסמן ואח. ^{5 , 6}. ב פרוטוקול זה, autocorrelation החישובים מבוצעים פיג ‘ י/ImageJ, כמו גם יישום גליונות אלקטרוניים, ניתן לתאר את הבסיס עבור הפונקציה autocorrelation המרחבי עוצמת התנודה (Eq 1):

     

כאשר F מייצג התמרת פורייה; F^{− 1} ההופכי פורייה שינוי צורה; F * המרוכב שלה; השהיה המרחבי משתנים חדוה , η. ב- ICS המרחבי, כפי שמתואר פרוטוקול זה, הפונקציה autocorrelation ניתן לחשב באמצעות 2D מהר פורייה המרה אלגוריתם^7,9. Autocorrelation-אפס הפרדה מרחבית הידוע גם אפס-בעומר, ג’י₁₁(0, 0), מספק את ההופכי רשע מספר החלקיקים מתנת קרן שטח של המיקרוסקופ. ניתן להשיג על-ידי הזזת את הפונקציה autocorrelation מרחבי פונקציה גאוסיאנית דו-ממדית (Eq 2):

     

הפיקסלים שנתפסו בתמונה מוכלים בתוך אזור קבוע, מדידות אלה לא להרחיב עד אינסוף, המונח g∞ משמש היסט להביא בחשבון מתאמים המרחבי לטווח ארוך בתוך התמונה. למצרפי בגודל מולקולרי, ω הפונקציה בנקודה-התפשטות של המיקרוסקופ, שתואר על ידי רוחב המלא מקסימום חצי של הפונקציה autocorrelation המרחבי. השטח הכלול בתוך הפונקציה הליין של המכשיר התפקיד באמצעות חרוזים פלורסנט משנה רזולוציה.

עבור התמונה המתאם ספקטרוסקופיה פרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, autocorrelation ואת פונקציות מתמטיות הדרושים להשלמת ICS מבוצעות באמצעות פלטפורמת עיבוד הדמיה של קוד פתוח, פיג’י¹⁰, הפצת ImageJ תוכנית^11,12. פיג ‘ י/ImageJ מנצל את השינוי פורייה מהירה שהותקנו מראש בפונקציה FFT במתמטיקה. פונקציה זו מקצרת את זמן מחשוב נדרש חישוב זה על-ידי הפחתת טווח הנתונים במקדם של שניים בכל ממד¹³. כמו בפונקציה 2D autocorrelation הוא סימטרי כ x, ציר y, מגרש פרופיל קו בודד על התמונה autocorrelation יכול לשמש כדי למדוד את autocorrelation גלם כפונקציה של השהיה מרחבית. רעש אפס-בעומר מוסר לפני בהמשך חישוב, עם משרעת autocorrelation וכתוצאה מכך (ערך שיא, g(0)_T) מתוקנות על רקע עם הביטוי (Eq 3):

     

איפה אני_b הוא עוצמת רשע אזור רקע למעט התא. צפיפות אשכול, או צפיפות של אובייקטים פלורסנט, מוגדרת על-ידי (Eq 4):

    

בפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, אנחנו עוד יותר פשוט חישוב צפיפות אשכול (CD), עם ההנחה בהתאם את התצפית כי פונקציה autocorrelation מנורמל תרקב לערך מתקרב 1.0 עם הגדלת לג מרחבית. עם השהיה המרחבי המרבי, יש עוד שום קורלציה של קרינה פלואורסצנטית ערכי העוצמה ומיחשוב ובכך ללא מתאם החישובים על אזור זה הם הערך של עוצמה מוכפל הזה בעוצמה אשר מחולק לאחר מכן ב- כיכר בעוצמה הזו, אשר מעצם הגדרתו הוא שווה ל- 1.0. לפיכך, אשכול צפיפות של פונקציה autocorrelation מנורמל יכול להיות מחושב על-ידי חיסור 1.0 מהפונקציה autocorrelation מנורמל לפני נטילת כל הדדיים (Eq 5):

     

ניתן לבצע כיול נוסף של האזור קרן כדי quantitate את מספר אשכולות בתוך האזור של הפונקציה הליין של המכשיר. כיול זה חייב להתבצע תוך שימוש באותם תנאים אופטי המשמש במהלך ניתוח ספקטרוסקופיה המתאם התמונה.

Protocol

1. זריעה של שורות תאים חסיד הדמיה ניסוי זרע 10,000 תאים סרטן epidermoid A431 לכל לילה טוב (O/N) ב- 300 µL של המדיה ששינה נשר בינוני/מזין תערובת F-12 (DMEM/F-12) של Dulbecco המכילה 10% סרום שור עוברית, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 1% GlutaMAX ב 8 תאיים הדמיה שקופית מתאים ברזולוציה גבוהה שמן טבילה המטרה עדשות (למשל, NuncTM מע…

Representative Results

ניסוי ספקטרוסקופיה של המתאם תמונה מוצלחת תלויה היישום של טיפול פקדים. קבוצות טיפול אלה כוללים הבחינה של זריחה נוגדן ראשוני אין וקבוצות טיפול אין נוגדנים משניים. ברגע ההגדרות של האופטימלית לייזר קונפוקלי מבוססים על ניסוי, תמונות חייב להתפס בקבוצות אלה בקרה כדי לוודא היע?…

Discussion

הטכניקה של התמונה המתאם ספקטרוסקופיה (ICS) שמתארים לנו ב פרוטוקול זה משתמש מיקרוסקופ קונפוקלי רגיל ללא צורך גלאים מיוחדים. ICS בטכניקה המתוארת מנצל immunocytochemistry ומבוססת שיטות כדי לספק עבור דיגום מהיר של תנאים מרובים הטיפול לניתוח סטטיסטי מוגברת. מתודולוגיה זו עושה את זה עם הפחתה קלה של דיוק מו?…

Materials

Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG