En protokol i matrix assisted laser desorption ionisering tid flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS) karakterisering af syntetiske polymerer er beskrevet herunder optimering af prøveforberedelse, spektrale erhvervelse og dataanalyse.
Der er mange teknikker, som kan være ansat i karakterisering af syntetiske homopolymerer, men få giver så nyttige oplysninger for udgangen gruppe analyse som matrix assisted laser desorption ionisering tid for flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS). Denne tutorial viser metoder til optimering af prøveforberedelse, spektrale erhvervelse og dataanalyse af syntetiske polymerer bruger MALDI-TOF MS. kritiske parametre under prøveforberedelse omfatter udvælgelsen af matrixen, identifikation af en passende cationization salt, og tuning de forholdsvise mængder af matrix, kation og analysand. Erhvervelse parametre, såsom mode (lineær eller reflektor), polarisering (positive eller negative), acceleration spænding og forsinkelsestid, er også vigtige. Givet nogle viden om kemi involveret til at syntetisere polymeren og optimere både data erhvervelse parametre og prøve forberedelse betingelser, bør spectra opnås med tilstrækkelig opløsning og masse nøjagtighed for at aktivere den utvetydige bestemmelse af grupperne slutningen af de fleste homopolymerer (masserne under 10.000) ud over de gentagne enhed masse og den samlede molekylvægt fordeling. Selvom demonstreret på et begrænset sæt af polymerer, er disse generelle teknikker gældende for en langt bredere vifte af syntetiske polymerer til bestemmelse af massen distributioner, selvom slutningen gruppe bestemmelse er kun muligt for homopolymerer med smalle dispersity.
Med forbedringer i levende polymerisering teknikker, præcision polymerer med kvantitativt functionalized ende grupper er stadig tilgængelig1. Den samtidige udvikling af indeholder-alkyn og thiolene Klik kemi har aktiveret den næsten kvantitative kobling af makromolekyler til andre fraspaltning, giver adgang til en række af hybrid materialer2,3,4 . Imidlertid skal præcis analytiske teknikker karakterisere både af råvarer og produkter af disse polymer konjugation reaktioner. Matrix assisted laser desorption/Ionisation tid for flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS) er en værdifuld bløde ionisering analytiske teknik til kendetegner polymerer, fordi det kan generere polymer ioner i en enkelt opladning stat med minimal fragmentering5,6. MALDI-TOF MS har store fordele i forhold til andre konventionelle metoder af polymer karakterisering, fordi det kan give massespektre med opløsning af den enkelte n-mers inden for polymer massedistribution. Som en konsekvens, kan sådan massespektre give præcise oplysninger om den gennemsnitlige molekylvægt, gentage masseenhed og Molekylær vægt dispersity7, som igen kan belyse konkurrerende polymerisering mekanismer såsom kæde overførsel8 . Men MALDI-TOF MS er særligt kraftige til at give oplysninger om polymer ende grupper9,10, som kan bruges til at bekræfte afslutningen gruppen ændringer10,11 og andre transformationer12 såsom polymer cyclizations11,13. Lige så vigtigt, de relativt små beløb af analysanden (sub-mikrogram) kræves til masse spektrometrisk analyse gør denne teknik nyttigt for karakterisering, når der kun spormængder materiale findes.
MALDI-TOF MS-analyse af polymerer kan opdeles i fire særskilte trin: prøve forberedelse, instrument kalibrering, spektrale erhvervelse og dataanalyse. Forberedelse af prøver er det mest afgørende skridt til at generere optimeret MALDI-TOF massespektre og opstår før prøven er indført i instrument14,15. Udvælgelsen af en passende matrix med lignende opløselighed parametre som polymer analysanden er afgørende for at opnå høj kvalitet MALDI-TOF massespektre og retningslinjer for matrix udvalg har været rapporteret et andet sted14,15, 16,17. En database med polymer MALDI “opskrifter” for prøveforberedelse har også været offentliggjort online18. For romanen polymerer, kan matrix udvalg gribes an ved første forståelse opløseligheden af polymeren og vælge en matrix med lignende opløselighed parametre14,19. Polymerer med høj proton affinitet kan være protonated af de fleste matricer14 (som ofte indeholder carboxylsyre grupper), men for andre polymerer, en cationization agent er påkrævet14. Alkali ioner addukt godt med ilt-holdige arter (fx. polyester og polyethers), mens umættede carbonhydrider (fx. polystyren) addukt med overgangen metaller såsom sølv og kobber ioner14, 19. da polymer prøver i dette eksperiment indeholdt iltatomer i rygraden, natrium eller kalium trifluoroacetate (TFA) blev brugt som cationization agent. Når matrix og cationization agenterne er blevet udvalgt, skal de forholdsvise mængder af analysand, kation agent og matrix optimeres omhyggeligt for at sikre høj signal til støj. I denne procedure, parametre for prøveforberedelse er allerede blevet optimeret, men en empirisk prøve optimering procedure (trin 1.4.1., figur 1), systematisk varierer koncentrationerne af de tre komponenter (analysand, matrix og kation) er effektiv til at hurtigt bestemme deres optimale forhold.
Dataindsamling kræver også optimering af en række parametre. De vigtigste parametre omfatter positive eller negative ion mode i spektrometeret, instrument operation tilstand (lineær versus reflektor), acceleration spænding og udvinding forsinkelsestiden. En anden måde, opløsning kan forhøjes er gennem udnyttelsen af “reflectron” tilstand20,21,22,23. Reflectron tilstand hovedsagelig fordobler flyvebane af ioner til detektoren ved afspejler ioner i slutningen af flyvningen tube tilbage mod en detektor nær kilde samtidig rette ioner med forskellige momentums, og derfor øge opløsningen selv faldende signalstyrke. Desuden kan højere opløsning spektre opnås ved at mindske den laser power, som minimerer signal til støjforhold med faldende antal og energi af kollisioner og derfor reducere fragmenteringen og kinetic inhomogeneities24. Tuning alle disse parametre, kan ioner være fokuseret for at minimere effekten af nogen uensartethed i udgangsstilling eller hastighed, der opstår under laser desorption proces. Når erhvervelse parametrene er optimeret, kan isotopiske opløsning ofte opnås for ioner med masserne over 10.000 Da, selv om dette er også afhængig af længden af flyvningen tube og instrument design. Mest organiske forbindelser, der indeholder mindst én betegnelse er tilbøjelige til kompleksbindende med alkali kationer såsom lithium, natrium og kalium. Mange af alkalimetaller er monoisotopes eller begrænset isotoper og derfor ikke udvider fordeling.
Mens instrument parametre kan indstilles for at optimere data præcision, opnås data nøjagtighed kun med en passende kalibrering11. Proteiner og peptider blev oprindeligt brugt som calibrants på grund af deres monodispersity og tilgængelighed, men lider af variable stabilitet og forekomsten af urenheder25. Mere omkostningseffektiv og stabil alternativer har inkluderet uorganiske klynger og polydisperse polymerer26,27,28,29. Desværre er disse alternativer funktion sprede masserne, der komplicerer masse tildelinger, såvel som mindre masserne samlet, hvilket gør dem nyttige kun for kalibreringer under 10.000 Da. At bekæmpe disse problemer, Grayson mfl. 25 udviklet en dendrimer-baseret, polyester MS kalibreringssystem, der er monodisperse, og kan prale med både brede matrix og solvent kompatibilitet, holdbarhed stabilitet (> 8 år), og lavere produktionsomkostninger. Baseret på de stærke sider ved dette system, blev det valgt som kalibratoren for disse eksperimenter.
Der er to hovedtyper af kalibrering: interne og eksterne30. Når kalibrering eksternt, placeres en standard med masserne, der beslag analysandens på MALDI target pladen i en anden prøve holdning end analysanden, der skal generere separat massespektrum hvorfra en kalibrering fil kan genereres. På den anden side kan øget nøjagtighed ofte opnås med en intern kalibrering, som involverer blanding af kalibratoren med analysanden, der skal opnå en hybrid spektrum med både kalibratoren og analysanden signaler. I nedenstående fremgangsmåde, blev en ekstern kalibrering gennemført. Efter korrekt kalibrering af den masse skala, kan nøjagtig analysand masse data erhverves. For at sikre den mest præcise kalibrering, er det vigtigt, at dataopsamling sker snart efter kalibrering.
Endelig, når den optimeret, kalibreret datasæt er anskaffet, og dataene blev analyseret for at give strukturelle oplysninger om polymer prøver. Afstanden mellem n-mers inden for polymer fordeling kan give nøjagtig måling af enhedens gentaget masse. Antal gennemsnitlig molekylvægt (Mn) og masse distribution beregninger (fxMw (vægten gennemsnitlig molekylvægt) og Đ (dispersity)) kan også bestemmes fra signal distribution hos massespektre ( trin 4.2 for beregninger). Måske mest unikt kan ved homopolymerer, summen af slutningen gruppe masserne bekræftes ved bestemmelse af forskydningen af polymer fordeling med hensyn til massen af de gentagne enheder alene. Informationsrige MALDI-TOF massespektre give værdifulde karakterisering data, der er komplementær til mere traditionelle polymer karakterisering teknikker såsom størrelse udstødelse kromatografi, Fouriertransformation infrarød spektroskopi, og Kernemagnetisk resonans.
MALDI-TOF-massespektrometri er en uvurderlig analytisk værktøj for polymer karakterisering på grund af dens evne til at generere polymer ioner i tilstanden enkeltvis opladet og med minimal opsplitning. Denne bløde ionisering teknik anvender korte laser bælgsæd til at desorb solid-state prøver af polymer analysanden indkapslet i en matrix sammensatte at generere polymer ioner i gasfasen. Makromolekyler er typisk ioniseret af kompleks med kationer, der er føjet til matrixen til at aktivere deres analyse af massespektrometri. Disse makromolekylære ioner er derefter fremskyndet af en udvinding spænding at bringe dem i regionen felt-fri flyvning røret, som kan aktivere deres m/z bestemmes baseret på deres time-of-flight mellem ion kilde og detektor5 , 32.
Sammenlignet med andre polymer karakterisering teknikker, er MALDI-TOF MS-spektre kvalitet stærkt afhængige af data erhvervelse parametre og forberedelse af prøver. Selv om der er ingen sæt formel for prøveforberedelse, forståelse funktion af hver bestanddel af prøveforberedelsen giver mulighed for hurtigere empiriske optimering. Den vigtigste faktor i MALDI prøveforberedelse er udvalg af matrixen, fordi kompatibilitet matrix med polymer analysanden er kritisk for at tillade ophidset matrix til at generere enkelt, desorberet makromolekyler i en ioniseret stat5, 15,17,19. Når passende matrix og cationization agenter er blevet udvalgt, bestemmes det korrekte forholdet mellem analysandens, matrix og cationization agent. Dette kan opnås empirisk ved at skabe et todimensionalt gitter af prøver (figur 1) på MALDI-TOF MS target plade (figur 2) med stigende matrix koncentration på en akse og stigende cationization agent koncentration på de andre.
Lig MALDI prøveforberedelse, der er ingen sæt formel til bestemmelse af data erhvervelse parametre; visse tendenser bør dog overvejes at fremskynde spektrale optimering. Reflectron tilstand, der øger beslutning, men nedsætter samlede signal, er typisk valgt for lavere masse intervaller (i disse eksempler, under 4.000 Da) hvor isotopiske beslutningen kan opnås. I disse tilfælde, blev monoisotopic masse beregninger og peak picking metoder anvendt. For polymer prøver med masserne over 4.000 Da, blev lineære tilstand brugt med gennemsnitlige masse beregninger og Topper picking metoder. For at forbedre signal opløsning, ion kilde spændinger skal justeres i små intervaller med den generelle tendens til større masse polymerer med en større spænding differential (IS1 versus IS2).
Mens optimeret prøveforberedelsen og erhvervelse parametre kan give præcision, masse nøjagtighed kan kun opnås gennem effektiv kalibrering. Time of flight for en given masse kan variere subtilt variable erhvervelse parametre og selv pladen positioner, derfor en kalibrering foretages for hvert sæt af optimeret erhvervelse parametre for at give nøjagtige masse bestemmelse5,30. Når erhvervelse parametre og forberedelse af prøver er blevet optimeret, bør spektrene kalibreres ved hjælp af disse nøjagtige samme betingelser.
På grund af ekstraordinære opløsning og masse nøjagtighed observeret i de optimerede MALDI-TOF massespektre af polymerer, er denne teknik blevet en værdifuld gratis værktøj til bestemmelse af polymer massedistribution data. Men dens evne til at løse individuelle gentage enheder inden for polymer massedistribution giver en særlig fordel for udgangen gruppe analyse i forhold til andre polymer karakterisering teknikker såsom gel gennemtrængning kromatografi (GPC) og nukleare Kernemagnetisk resonans (NMR). Dette er særligt værdifulde for bestemmelse af troskab i slutningen gruppe functionalization reaktioner og slutningen gruppe bøjninger reaktioner kvantitativ art. Dette manuskript har vist evne til at løse massen af individuelle polymer gentage enheder med op til to decimaler punkter af masse nøjagtighed, gør det muligt for bekræftelse af slutningen gruppen ændringer med en høj grad af tillid. Med de betydelige fremskridt, der er foretaget for nylig inden for precision polymer syntese, MALDI-TOF MS er ved at blive et stadigt vigtigere redskab til bestemme makromolekylære struktur og funktionalitet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender den Smart materialedesign, analyse og behandling consortium (SMATDAP) finansieret af National Science Foundation under samarbejdsaftale IIA-1430280 og LA bestyrelse Regents for et graduate stipendium (MEP). Polymer prøver for disse eksperimenter blev leveret af MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Åben adgang til offentliggørelsen af denne artikel er sponsoreret af MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |