Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.
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Articolo metodologico
Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga
In questo articolo
Sommario
Abstract
La possibilità di differenziare le cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) in epatociti-come le cellule (HLCs) offre nuove opportunità per studiare gli errori innati di metabolismo epatico. Tuttavia, per fornire una piattaforma che supporta l'identificazione di piccole molecole che potenzialmente può essere utilizzato per trattare la malattia del fegato, la procedura richiede un formato di impostazioni cultura che è compatibile con migliaia di composti di screening. Qui, descriviamo un protocollo utilizzando condizioni di cultura completamente definita, che consentono la differenziazione riproducibile delle iPSCs umane dell'epatocita-come le cellule in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Forniamo anche un esempio di utilizzo della piattaforma ai composti di schermo per la loro capacità di abbassare l'apolipoproteina B (APOB) prodotta dagli epatociti iPSC-derivato generati da un paziente di ipercolesterolemia familiare. La disponibilità di una piattaforma che è compatibile con la scoperta della droga dovrebbe consentire ai ricercatori di identificare approcci terapeutici per le malattie che colpiscono il fegato.
Introduzione
Successo nell'identificazione di farmaci che possono essere utilizzati per indirizzare una malattia rara si basa sullo sviluppo di analisi che può essere utilizzato per lo screening. Ipotesi o schermi basati su destinazione (inversa farmacologia) sono utili, ma richiedono una dettagliata comprensione delle basi molecolari della malattia. Fenotipici schermi (farmacologia classica) evitano la necessità di una comprensione dettagliata delle vie biochimiche, ma invece si basano sullo sviluppo di modelli che rispecchiano esattamente la patofisiologia della malattia. Nonostante l'entusiasmo per gli approcci basati su target, analisi delle droghe first-in-class approvato dal....
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Protocollo
1. la cultura dell'essere umano ha indotto le cellule staminali pluripotenti indotte
-
Rivestimento di altre matrici adatti a coltura hPSC o ricombinante umano proteina di fusione di E-caderina Fc (E-cad-Fc) 6
- Diluire E-cad-Fc a 15 μg/mL con soluzione fisiologica Phosphate-Buffered di Dulbecco contenente calcio e magnesio (DPBS (+)).
- Cappotto piatti di coltura del tessuto di sospensione 100 mm con 5 mL di diluito E-cad-Fc e incubare a 37 ° c per almeno 1 h. substrato di rimuovere e sostituire con 5 mL di terreno (ad es., mTeSR1 di cui d'ora in poi come M-medium)7.
....
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Risultati
Generazione degli epatociti - come cellule: Figura 1 descrive l'intervallo di tempo dei cambiamenti che si verificano durante la differenziazione delle iPSCs umane dell'epatocita-come le cellule. La cultura di iPSCs su E-Cad-Fc fornisce circa 2mm colonie di diametro che esprimono il marcatore di pluripotent OCT4 (Figura 1A-B). La morfologia delle cellule cresciut.......
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Discussione
Obiettivo basata scoperta di nuovi farmaci, dove vengono identificate piccole molecole che influenzano l'attività di una proteina specifica, è stato al centro di molti sforzi di selezione esistente. Anche se questo approccio ha fornito numerosi prodotti farmaceutici, schermi basati sull'inversione di un fenotipo, la farmacologia classica, hanno avuto più successo nell'individuazione di composti di first-in-class che sono stati clinicamente efficace1. Uno svantaggio di scoperta della droga fenotipi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 a Sad). Vorremmo ringraziare il Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Ran Jing per i loro contributi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre sterili per colture tissutali da 100 mm x 20 mm. | Piastre di coltura in | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm | Piastra | ||
| 96 pozzetti | Corning | 3595 | |
| Albumina anti-umana | Dako | A 0001 | |
| Anti-umano FOXA2 (6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-umano HNF4 alfa | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-umano Oct-3/4 anticorpo | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-umano SOX17 | R& D | AF1924 | |
| Millipore | coniugato anti-umano TRA-1-60 FITC | FCMAB115F | |
| Activina A Proteina umana ricombinante | Integratore Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27, meno insulina | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Integratore, senza siero | Invitrogen | 17504044 | |
| proteina umana ricombinante BMP4 | Invitrogen | PHC9533 | |
| reagente per dissociazione cellulare StemPro Accutase | Saggio | Invitrogen A1110501 | |
| CellTiter-Glo | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcio, magnesio) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(senza calcio, senza magnesio) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | ||
| Mabtech | 3715-1H-20 | ||
| Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) | Invitrogen | ||
| (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Fattore di crescita degli epatociti (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutammina | Soluzione di | 25030081 | |
| MEM | Invitrogen | 11140076 | |
| oncostastatina M (OSM) | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillina-Streptomicina | feeder Invitrogen | ||
| : mTesR1 | Tecnologie STEMCELL | 5850 | |
| Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medio, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Matrice definita per hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Soluzione di substrato | Thermo Scientific | 34022 | |
| Millipore | coniugato anti-TRA-1-60 FITC | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0,02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 inibitore ROCK | STEMCELL Technologies | 72302 |
Riferimenti
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (20....
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Ristampe e permessi
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