Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.
Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Compactação do DNA é um evento citoplasmático dramático recentemente encontrado para ocorrer em algumas cianobactérias antes da divisão celular. No entanto, devido o tamanho de células grandes e o caráter transitório, é difícil investigar a estrutura em detalhes. Para superar as dificuldades, primeiro, compactação do DNA é reproducibly produzida na associação Synechococcus elongatus PCC 7942 pela cultura síncrona usando 12 h cada ciclo claro/escuro. Em segundo lugar, compactação do DNA é monitorizada por microscopia de fluorescência e capturada por congelação rápida. Em terceiro lugar, a estrutura detalhada do DNA compactado células é visualizado em três dimensões (3D) pela tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Este conjunto de métodos é amplamente aplicável para investigar estruturas transientes em bactérias, por exemplo, a divisão celular, segregação do cromossomo, infecção do fago , etc., que são monitorados por microscopia de fluorescência e visualizado diretamente pela tomography do Cryo-elétron em pontos de tempo apropriado.
Compactação do DNA é um acontecimento dramático citoplasmático que foi identificado em algumas cianobactérias. Quando Synechococcus elongatus era culta, abaixo dos 12 h cada ciclo claro/escuro, DNA aparecido condensada no final do período de luz, que era claramente diferente da sua aparência na época outra pontos1. Tem sido sugerido que este processo é controlado por um relógio circadiano baseado no Kai proteínas2. Seki et al relataram que o ADN manchado com Hoechst 33342 foi compactado em S. elongatus células no final do período de luz e mostrou uma ondulada em forma de haste sob um microscópio de fluorescência. O DNA compactado então separados em dois no centro da haste que a célula dividida e finalmente retornou para uma distribuição uniforme normal em cada célula filha3. No entanto, sua natureza transitória e tamanho grande para microscopia eletrônica impediu a análise estrutural. Murata et al combinados vários métodos, incluindo a cultura síncrona, microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tensão elétron cryo-tomografia computadorizada (cryo-HVET) e conseguiu identificar a estrutura de transiente compactação do DNA, incluindo a cinética de polifosfato corpos (PPBs)4. O manuscrito fornece uma explicação visual de um material tão difícil em detalhe, combinando os procedimentos experimentais.
S. elongatus tem uma forma de cápsula, um comprimento de 2 a 5 µm, uma largura de sobre 0.5 µm e a perfeita compactação do DNA aparece em células vivas apenas para um tempo muito curto. Portanto, as mudanças estruturais que ocorrem na compactação de DNA cianobactérias eram desconhecidas em detalhe. Para investigar essas estruturas por microscopia eletrônica, é necessário superar os dois principais problemas técnicos. Uma é a observação de um espécime tão grossa de toda bactéria em condições nativas quase, e o outro é a fixação rápida de uma estrutura dinâmica. Quanto ao primeiro problema, o percurso livre médio (iMFP) inelástico de elétrons varia de acordo com a tensão de aceleração do microscópio eletrônico5. Em um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de 300 kV, é menos de 350 nm. Por exemplo, quando uma associação de gelo-incorporado (espécime espessura ≈ 600 nm) é observada em 200kV TEM (≈ iMFP 250 nm), as estruturas no interior da célula são difíceis de observar. Por contraste, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) pode dar e imagem da estrutura citoplasmática em toda a célula (Figura 1). Neste protocolo, como uma parte da solução, um microscópio de alta voltagem (HVEM) em uma tensão de aceleração de 1 MV foi empregado. No entanto, as instalações que implementam HVEM limitam-se em todo o mundo. Possíveis soluções alternativas também são discutidas na seção de discussão. O segundo problema foi resolvido pela microscopia cryo-elétron (cryo-EM). Esta é uma poderosa ferramenta para a visualização de estruturas dinâmicas em condições nativas, onde a amostra é rapidamente congelada em etano líquido usando um dispositivo de congelação rápido, e o momento congelado é diretamente observado com um mínimo de modificações6quase. Combinando com tomografia computadorizada, um instantâneo de estruturas tridimensionais (3D) pode ser reconstruído da inclinação série7. Neste experimento, compactação do DNA foi reproduzida em s. elongatus usando síncrona cultura abaixo dos 12 h cada claro/escuro do ciclo, e o momento do congelamento da amostra foi determinado pelo monitoramento sob um microscópio de fluorescência.
As abordagens descritas aqui são amplamente aplicáveis ao estudo das estruturas dinâmicas em células bacterianas, por exemplo, a divisão celular, segregação do cromossomo e infecção do fago e têm um potencial para abrir novos caminhos na investigação microbiológica.
Nós apresentamos uma sequência de protocolos para a visualização de transiente compactação do DNA em cianobactérias. O conceito básico é semelhante da luz correlativo e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)12. Além disso, nesse método, cianobactérias ao vivo foram monitoradas por microscopia de fluorescência, rapidamente congeladas nas grades EM e visualizadas diretamente com tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Como uma primeira aplicação, a estrutura detalhada do DNA compactado células bacterianas com êxito foi visualizado em 3D. Atualmente, este procedimento é específico para este assunto, mas será aplicado mais extensivamente, com metodologia modificada em alguns casos. Aqui, as vantagens, as limitações e as possibilidades futuras deste método são discutidas.
Uma das vantagens deste método é a visualização em 3D da célula inteira. 1 MV HVEM visualizado com êxito a dinâmica estrutura das organelas subcelulares no DNA compactada de células. No entanto, a estrutura fina dentro de células normais não poderiam ser distinguida devido a imagem de baixo contraste. Aumentando inelástica e a dispersão de vários espécimes grosso desfoca a imagem13. Zero-perda e mais-provável-perda de imagem filtrando por um filtro de energia pode melhorar o contraste da imagem, reduzindo a dispersão inelástica14,15, mas não vai funcionar para amostras mais espessas do que iMFP. Os picos de perda nula e a maior perda de provável diminuem drasticamente com espessura do espécime. É particularmente difícil obter uma relação sinal / ruído suficiente para os espécimes elétron sensível incorporado no gelo. Murata et al . demonstraram que transmissão de digitalização de 1MV dá de microscopia (haste) maior contraste de imagem do que uma imagem de campo brilhante em plástico incorporado células de levedura com espessura de 5 µm, onde o contraste da imagem é principalmente dada pelo contraste de amplitude13 . No entanto, espera-se que o efeito de danos de arrastamento sobre elétrons acelerados superiores cria outra limitação para a dose de irradiação para danos sensíveis cryo-espécimes16. O pedido de Volta e Zernike fase placas17,18 de HVEM pode ser capaz de reduzir os danos de arrastamento, reduzindo a dose total no futuro. Outra limitação usando HVEM para espécimes grossos vem do fato de que as instalações do usuário que fornecem HVEM são escassas em todo o mundo.
Utilizando um método alternativo para observar espécimes grossos, tomografia computadorizada de crio-haste em 300 kV demonstrou imagens de alto contraste em espécimes congelados-hidratado com espessura superior a várias centenas de nanômetros19. Para recuperar o contraste de fase em crio-haste, microscopia eletrônica de pthychographic também foi introduzida, na qual a placa de fase na lente condensadora transpõe uma difração de fase modulada para detector 2D pixelado20. As imagens são recuperadas pelo cálculo de múltiplas difrações. Para direto e rápido 3D cryo-imagens de grande nativo congelada amostras, cryo-FIB-SEM também podem ser usado21, onde serial seccionamento com um feixe de íon focalizado e bloquear a imagem do rosto é aplicada para a imagem totalmente hidratado amostras congeladas. Embora estas tecnologias expandem o intervalo de visualização de espécimes biológicos, é difícil encontrar o local de destino das bactérias, rotulado por exemplo, as bactérias, porque o alvo está completamente sob o gelo e não pode ser identificado antes de aparar.
Compactação do DNA produz uma estrutura distinta em cianobactérias. DNA compactado células distinguem-se facilmente mesmo sem ser manchada devido a um viés de grande densidade no interior das células que não está presente em células normais. No entanto, a fim de Visualizar mais eventos locais dentro da célula, é necessário transferir o ROI fluorescente etiquetado para o microscópio de elétron. Para correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM), imagens de microscópio de luz e microscópio eletrônico são geralmente correlacionadas usando contas de látex fluorescentes ou pontos quânticos em localizador grades12. As partículas de rotulagem devem ser de densidade de elétrons alta além de fluorescência. Eles podem com precisão e confiabilidade correlacionar as posições entre as duas imagens. Além disso, confirmando a área rotulada com microscopia cryo-luz, completa sobreposição de ROI pode ser conseguida entre os dois microscópios. Quando caracterizam eventos estruturais mais detalhados na compactação do DNA, estas partículas e microscópio crio-luz será uma ferramenta indispensável para uma correlação mais robusta e precisa no futuro.
Este artigo mostra como caracterizar a estrutura transitória de compactação do DNA em cianobactérias por uma combinação de cultura síncrona, microscopia de fluorescência e tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Este protocolo centra-se na observação de DNA compactada. Combinando este método com outras novas tecnologias mencionadas acima, será possível investigar o processo de compactação do DNA em um detalhe mais adicional, e devidamente modificados métodos são amplamente aplicáveis a outros eventos dinâmicos e estruturais em bactérias.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecer Tammo Reisewitz leitura crítica do manuscrito e Mako Hayashi e Sayuri Hagiwara para cultivo de cuidado e observação das cianobactérias, Yoshitaka Kimori para processamento de imagem, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki e Miyoko Nagayoshi por ajudar com a segmentação das estruturas. Este trabalho foi financiado pelo programa de estudo colaborativo do Instituto Nacional de Ciências fisiológicas (NIPS) para YK
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |