Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. Synchrone teelt, toezicht door fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie worden gebruikt. Een protocol voor deze methodologieën wordt gepresenteerd, en toekomstige toepassingen en ontwikkelingen worden besproken.
Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. DNA verdichting is een dramatische cytoplasmatische evenement onlangs gevonden optreden in sommige blauwalgen voordat celdeling. Als gevolg van de grote Celgrootte en het voorbijgaande karakter is het echter moeilijk te onderzoeken van de structuur in detail. Om te overwinnen van de moeilijkheden, eerst is DNA verdichting reproducibly geproduceerd in de cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 door synchrone cultuur met behulp van de 12 h elke licht/donker cyclus. Ten tweede, DNA verdichting is gecontroleerd door fluorescentie microscopie en gevangen genomen door snelle bevriezing. Ten derde, de gedetailleerde structuur van DNA gecomprimeerd cellen is gevisualiseerd in drie dimensies (3D) door hoogspanning cryo-Elektronentomografie. Deze set van methoden is breed inzetbaar te onderzoeken van tijdelijke structuren in bacteriën, bijvoorbeeld de afdeling van de cel, chromosoom segregatie, faag infectie enz., die worden gecontroleerd door fluorescentie microscopie en direct gevisualiseerd door Cryo-Elektronentomografie op passende tijdstippen.
DNA verdichting is een dramatische cytoplasmatische evenement dat in sommige blauwalgen is geconstateerd. Wanneer Synechococcus elongatus werd gekweekt tot 12u elke licht/donker cyclus, DNA verkorte verscheen aan het eind van de periode van licht, die duidelijk afweek van haar verschijning op het andere moment wijst1. Er is gesuggereerd dat dit proces wordt gecontroleerd door een circadiane klok op basis van de Kai eiwitten2. Seki et al. hebben gemeld dat het DNA gekleurd met Hoechst 33342 was gecomprimeerd in S. elongatus cellen tegen het einde van de periode van lichte en toonde een golvende staaf-vorm onder een fluorescentie Microscoop. Het gecomprimeerde DNA wordt onderverdeeld in twee in het midden van de staaf als de cel verdeeld, en ten slotte keerde terug naar een normale uniforme verdeling in elke dochtercel3. Echter belemmerd de voorbijgaande aard en groot formaat voor elektronenmicroscopie structurele analyse. Murata et al. gecombineerd verschillende methoden, met inbegrip van synchrone cultuur, fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie (cryo-HVET), en geslaagd bij het identificeren van de structuur van voorbijgaande DNA verdichting, met inbegrip van de eliminatiekinetiek polyfosfaat organen (PPBs)4. Het manuscript bevat visuele uitleg van een dergelijke moeilijke materie in detail door het combineren van de experimentele procedures.
S. elongatus heeft een capsule vorm, een lengte van 2 tot en met 5 µm, een breedte van over 0,5 µm en de perfecte DNA-verdichting in levende cellen alleen voor een zeer korte tijd weergegeven. Daarom waren de structurele veranderingen in de cyanobacteriën DNA verdichting onbekend in detail. Om te onderzoeken deze structuren door elektronenmicroscopie, is het noodzakelijk om twee belangrijkste technische problemen te overwinnen. Een is de waarneming van dergelijke een dikke specimen van de hele bacterie bij in de buurt van native voorwaarden, en anderzijds de snelle vastlegging van een dynamische structuur. Wat het eerste probleem, is het inelastisch gemiddelde gratis pad (iMFP) van elektronen afhankelijk van de versnellende spanning van de elektronenmicroscoop5. In een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) van 300 kV, het is minder dan 350 nm. Bijvoorbeeld, wanneer een ijs-ingebedde cyanobacterium (specimen dikte ≈ 600 nm) is waargenomen in 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm), de structuren binnen de cel zijn moeilijk te observeren. Door contrast, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) kan geven en beeld van de cytoplasmatische structuur in de cel (Figuur 1). In dit protocol, als een deel van de oplossing, een elektronenmicroscoop hoogspanning (HVEM) bij een versnellende spanning van 1 MV werkte. Echter zijn de faciliteiten die HVEM implementeren wereldwijd beperkt. Mogelijke alternatieve oplossingen worden ook besproken in de sectie discussie. Het tweede probleem werd opgelost door cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Dit is een krachtige tool voor het visualiseren van dynamische structuren op in de buurt van native voorwaarden, waar het model is snel bevroren in vloeibaar ethaan met behulp van een snelle bevriezing apparaat, en het bevroren moment is rechtstreeks waargenomen met een minimum aan wijzigingen6. Combineren met tomografie, een momentopname van driedimensionale (3D) structuren kan worden gereconstrueerd op basis van de tilt serie7. In dit experiment, DNA verdichting werd gereproduceerd in S. elongatus met synchrone cultuur tot 12u elke licht/donker cyclus en de timing van de bevriezing van het model werd bepaald door het toezicht op onder een fluorescentie Microscoop.
De benaderingen die hier worden beschreven zijn breed toepasbaar is op de studie van dynamische structuren in bacteriële cellen, bijvoorbeeld de afdeling van de cel, chromosoom segregatie en phage infectie, en hebben een potentieel om te openen nieuwe wegen in microbiologisch onderzoek.
We hebben een reeks van protocollen voor het visualiseren van voorbijgaande DNA verdichting in cyanobacteriën gepresenteerd. Het basisconcept is vergelijkbaar met die van oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)12. Bovendien, in deze methode, werden live cyanobacteriën gecontroleerd door fluorescentie microscopie, snel bevroren op EM rasters en direct gevisualiseerd met hoogspanning cryo-Elektronentomografie. Als een eerste toepassing, de gedetailleerde structuur van DNA gecomprimeerd bacteriecellen werd met succes gevisualiseerd in 3D. Momenteel is deze procedure geldt specifiek voor dit onderwerp, maar uitgebreider, zal worden toegepast met de gewijzigde methodologie in sommige gevallen. Hier, worden de voordelen, de beperkingen en de toekomstige mogelijkheden van deze methode besproken.
Een van de voordelen van deze methode is de 3D visualisatie van de hele cel. 1 MV HVEM gevisualiseerd met succes de dynamische structuur van de subcellular organellen in het DNA gecomprimeerd cellen. De fijne structuur in normale cellen kon echter niet worden onderscheiden als gevolg van lage afbeeldingscontrast. Toenemende inelastisch en meerdere verstrooiing in dikke specimens vervaagt de afbeelding13. Nul-verlies en meeste-waarschijnlijk-verlies beeld filteren op een energie-filter afbeeldingscontrast kunt verbeteren door het verminderen van inelastische verstrooiing14,15, maar het zal niet werken voor specimens die dikker zijn dan iMFP. De nul-verlies alsmede de meeste-waarschijnlijk pieken verlagen drastisch met specimen dikte. Het is bijzonder moeilijk te verkrijgen van een voldoende signal-to-noise verhouding voor de elektron gevoelige ijs-ingesloten specimens. Murata et al. is gebleken dat de 1MV scannen transmissie microscopie (STEM)-geeft hoger afbeeldingscontrast dan een heldere veld afbeelding in kunststof ingesloten gistcellen met 5 µm dikte, waar het afbeeldingscontrast wordt hoofdzakelijk gegeven door amplitude contrast13 . Verwacht wordt echter dat het effect van Domino schade op hogere versnelde elektronen een andere beperking aan de dosis van de bestraling voor schade-gevoelige cryo-exemplaren16 creëert. De toepassing van de Volta en Zernike fase platen17,18 voor HVEM mogelijk Domino om schade te beperken door vermindering van de totale dosis in de toekomst. Een andere beperking voor het gebruik van HVEM voor dikke specimens afkomstig is van het feit dat de gebruiker voorzieningen waarmee HVEM schaarse wereldwijd.
Met behulp van een alternatieve methode om te observeren dikke specimens, cryo-stam tomografie op 300 kV gebleken contrastrijke beelden op bevroren-gehydrateerd exemplaren met dikte meer dan enkele honderden nanometer19. Om op te halen fase contrast in cryo-stam, is pthychographic elektronenmicroscopie ook ingevoerd, waarin de plaat van de fase in de condensor lens zet een fase-gemoduleerd diffractie aan een korrelig 2D detector20. De beelden worden opgehaald door berekening uit meerdere diffractions. Voor direct en snel 3D-cryo-imaging voor grote native bevroren monsters, cryo-FIB-SEM kan ook worden gebruikt21, waar seriële afdelen met een gerichte ion beam en gezicht beeldvorming blokkeren is toegepast voor beeldvorming gehydrateerd volledig bevroren exemplaren. Hoewel deze technologieën uit te het bereik van de weergave van biologische specimens breiden, is het moeilijk om te vinden de doellocatie van de bacteriën, bijvoorbeeld het label van bacteriën, omdat het doel volledig onder het ijs is en kan niet worden geïdentificeerd voordat trimmen.
DNA verdichting produceert een duidelijke structuur in cyanobacteriën. DNA gecomprimeerd cellen zijn gemakkelijk DN zelfs zonder als gevolg van een grote dichtheid vooroordeel binnen de cellen die niet aanwezig zijn in normale cellen wordt gekleurd. Om meer lokale evenementen binnen de cel te visualiseren, is het echter noodzakelijk de fluorescently geëtiketteerde ROI overbrengen naar de elektronenmicroscoop. Voor oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), zijn lichte Microscoop afbeeldingen en elektronenmicroscoop afbeeldingen over het algemeen gecorreleerd met behulp van fluorescerende latex kralen of quantumdots op EM finder rasters12. De etikettering deeltjes moet hoge elektronen dichtheid naast fluorescentie. Ze kunnen nauwkeurig en betrouwbaar correleren de standpunten tussen de twee beelden. Bovendien, door de bevestiging van het gelabelde gebied met cryo-licht microscopie, volledige overlapping van ROI kan worden bereikt tussen de twee microscopen. Wanneer het karakteriseren van meer gedetailleerde structurele gebeurtenissen in DNA verdichting, zullen deze deeltjes en cryo-light Microscoop een onmisbaar instrument voor een meer robuuste en nauwkeurige correlatie in de toekomst.
Dit artikel laat zien hoe de voorbijgaande structuur van DNA verdichting in cyanobacteriën wordt gekenmerkt door een combinatie van synchrone cultuur, fluorescentie microscopie en hoogspanning cryo-Elektronentomografie. Dit protocol is gericht op de waarneming van gecomprimeerde DNA. Door deze methode te combineren met andere nieuwe technologieën die hierboven vermeld, zal het mogelijk zijn om het proces van DNA verdichting nader te onderzoeken, en voldoende gemodificeerde methoden zijn breed toepasbaar op andere dynamische structurele gebeurtenissen in bacteriën.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Tammo Reisewitz voor kritische lezing van het manuscript, en zowel Mako Hayashi en Sayuri Hagiwara voor zorgvuldige teelt en waarneming van cyanobacteriën, Yoshitaka Kimori voor beeldverwerking, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki en Miyoko Nagayoshi voor het helpen met segmentatie van de structuren. Dit werk werd gesteund door het gezamenlijke programma van de studie van het Nationaal Instituut voor fysiologische Wetenschappen (NIP’s) aan Y.K.
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |