Ce protocole décrit comment visualiser la compaction de l’ADN transitoire chez les cyanobactéries. Culture synchrone, suivi par la microscopie en fluorescence, congélation rapide et élevé tomographie cryo-électronique de tension sont utilisés. Un protocole pour ces méthodologies est présenté, et discutent de développements et futures applications.
Ce protocole décrit comment visualiser la compaction de l’ADN transitoire chez les cyanobactéries. Compaction de l’ADN est un dramatique événement cytoplasmique récemment trouvé à se produire dans certaines cyanobactéries avant la division cellulaire. Toutefois, en raison de la taille de grandes cellules et le caractère transitoire, il est difficile d’enquêter sur la structure en détail. Pour surmonter les difficultés, tout d’abord, compaction de l’ADN est reproductible produite dans la cyanobactérie Synechococcus elongatus PCC 7942 par culture synchrone à l’aide de 12 h chaque cycle lumière/obscurité. Deuxièmement, compaction de l’ADN est contrôlée par la microscopie en fluorescence et capturée par congélation rapide. Troisièmement, la structure détaillée de l’ADN compacté cellules est visualisée en trois dimensions (3D) par tomographie cryo-électronique haute tension. Cet ensemble de méthodes est largement applicable pour étudier les structures transitoires dans les bactéries, par exemple la division cellulaire, ségrégation des chromosomes, infection par le phage etc.., qui sont surveillés par la microscopie en fluorescence et visualisées directement par tomographie Cryo-électronique aux moments appropriés.
Compaction de l’ADN est un événement dramatique cytoplasmique qui a été identifié dans certaines cyanobactéries. Quand Synechococcus elongatus ont été cultivés sous 12 h chaque cycle lumière/obscurité, ADN apparu condensée à la fin de la période de lumière, qui était clairement différente de son apparence à l’époque d’autre points de1. Il a été suggéré que ce processus est contrôlé par une horloge circadienne basée sur les protéines de Kai2. Seki et coll. ont rapporté que l’ADN coloré avec Hoechst 33342 a été compacté dans les cellules de S. elongatus vers la fin de la période de lumière et a montré une forme tige ondulée sous un microscope à fluorescence. L’ADN compacté puis séparés en deux au centre de la tige que la cellule divisé et est finalement revenu à une répartition normale dans chaque cellule fille3. Cependant, son caractère transitoire et grande taille pour la microscopie électronique entravaient l’analyse structurale. Murata et coll. combiné plusieurs méthodes, notamment la culture synchrone, microscopie à fluorescence, congélation rapide et haute tension, cryo électrons-positons (cryo-HVET) et a réussi à identifier la structure de la compaction de l’ADN transitoire, y compris la cinétique de polyphosphate organes (RCB)4. Le manuscrit fournit une explication visuelle d’un matériau difficile en détail en combinant les procédures expérimentales.
S. elongatus a une forme de capsule, une longueur de 2 à 5 mm, une largeur d’environ 0,5 µm et la compaction de l’ADN parfaite apparaît dans les cellules vivantes que pour un temps très court. Par conséquent, les changements structurels qui se produisent dans la compaction de l’ADN cyanobactérienne étaient inconnues en détail. Afin d’enquêter sur ces structures en microscopie électronique, il est nécessaire de surmonter les deux principaux problèmes techniques. L’un est l’observation d’un tel spécimen épais de la bactérie tout à proximité de conditions natives, et l’autre est la fixation rapide d’une structure dynamique. En ce qui concerne le premier problème, le parcours libre moyen (iMFP) inélastique des électrons dépend de la tension d’accélération du microscope électronique5. Dans un microscope électronique à transmission (TEM) de 300 kV, il est inférieur à 350 nm. Par exemple, lorsqu’une cyanobactérie glace incorporé (spécimen épaisseur ≈ 600 nm) est observée en 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm), les structures à l’intérieur de la cellule sont difficiles à observer. En revanche, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) peut donner et l’image de la structure cytoplasmique tout au long de la cellule (Figure 1). Dans le présent protocole, dans le cadre de la solution, un microscope électronique à haute tension (HVEM) à une tension d’accélération de 1 MV a été employé. Toutefois, les installations qui implémentent HVEM sont limitées dans le monde entier. Des solutions de rechange possibles sont également abordées dans la section « Discussion ». Le deuxième problème a été résolu par cryo microscopie électronique (cryo-EM). Il s’agit d’un puissant outil de visualisation de structures dynamiques au près des conditions naturelles, où l’échantillon est congelé rapidement dans l’éthane liquide à l’aide d’un appareil de congélation rapid, et le moment gelé on observe directement avec un minimum de modifications6. Alliant à la tomographie, un instantané des structures tridimensionnelles (3D) peut être reconstruit à partir l’inclinaison série7. Dans cette expérience, compaction de l’ADN a été reproduite dans s. elongatus , à l’aide de la culture synchrone sous 12 h cycle de chaque lumière/obscurité, et le moment de la congélation de l’échantillon a été déterminé en surveillant sous un microscope à fluorescence.
Les approches décrites ici sont largement applicables à l’étude des structures dynamiques dans les cellules bactériennes, par exemple la division cellulaire, ségrégation des chromosomes et infection par le phage et risquent d’ouvrir de nouvelles avenues de recherche microbiologique.
Nous avons présenté une série de protocoles de visualisation transitoire compaction de l’ADN chez les cyanobactéries. Le concept de base est similaire à celle de la lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM)12. En outre, dans cette méthode, cyanobactéries vivantes ont été surveillés par microscopie de fluorescence, rapidement gelés sur les grilles de l’EM et visualisés directement avec la tomographie cryo-électronique haute tension. Comme une première demande, la structure détaillée de l’ADN compacté cellules bactériennes a été visualisé avec succès en 3D. Actuellement, cette procédure est spécifique à ce sujet, mais il sera appliqué de manière plus approfondie, avec une méthode modifiée dans certains cas. Ici, les avantages, les limites et les possibilités futures de cette méthode sont discutées.
Un des avantages de cette méthode est la visualisation 3D de la cellule entière. 1 MV HVEM visualisé avec succès la dynamique compactés de structure des organites subcellulaires dans l’ADN des cellules. Cependant, la structure fine à l’intérieur des cellules normales ne pouvait distinguer en raison du contraste de l’image faible. Augmentation d’inélastiques et diffusions multiples spécimens épais brouille l’ image13. Zéro-perte et plus-probable image filtrées par un filtre d’énergie peut améliorer le contraste de l’image en réduisant la diffusion inélastique14,15, mais cela ne fonctionnera pas pour les spécimens plus épais que l’iMFP. Les pics de zéro-perte et plus-probable diminuent considérablement avec l’épaisseur de l’échantillon. Il est particulièrement difficile d’obtenir un rapport signal-bruit suffisant pour les spécimens de glace incorporé sensibles d’électrons. Murata et coll. ont montré que transmission de balayage de 1MV donne de microscopie (tige) plus haut contraste de l’image qu’une image de champ lumineux en plastique intégrée des cellules de levure avec 5 µm d’épaisseur, où le contraste de l’image est principalement donné par contraste amplitude13 . Cependant, il est prévu que l’effet de dégâts de boule de neige sur les électrons accélérés supérieurs crée une autre limitation à la dose d’irradiation pour dommages sensibles cryo-spécimens de16. L’application de Volta et Zernike phase plaques17,18 pour HVEM peut être en mesure de réduire les dégâts de boule de neige en réduisant la dose totale à l’avenir. Une autre limitation à l’utilisation de HVEM pour échantillons épais vient du fait que les installations de l’utilisateur qui fournissent HVEM sont rares dans le monde entier.
En utilisant une autre méthode d’observer des échantillons épais, tomographie cryo-tige à 300 kV a démontré images à contraste élevé sur des échantillons congelés hydratés d’épaisseur supérieure à plusieurs centaines de nanomètres19. Pour récupérer le contraste de phase en cryo-tige, pthychographic la microscopie électronique a également été introduite, dans laquelle la plaque de phase dans la lentille condenseur transpose une diffraction modulés en phase à un pixélisé détecteur 2D20. Les images sont récupérées par des calculs de diffractions multiples. Cryo-imagerie directe et rapide 3D de grande originaire congelés échantillons, cryo-FIB-SEM peut aussi être utilisé21, où série sectionnant avec un faisceau ionique focalisé et bloquer le visage d’imagerie est appliqué pour l’imagerie entièrement hydratés échantillons congelés. Bien que ces technologies élargir le champ de vision de spécimens biologiques, il est difficile de trouver l’emplacement de la cible de la bactérie, étiqueté par ex. bactéries, car la cible est complètement sous la glace et ne peut être identifiée avant de tailler.
Compaction de l’ADN produit une structure distincte chez les cyanobactéries. ADN compacté cellules sont facilement distingués même sans être teinté en raison d’un préjugé de grande densité au sein des cellules qui n’est pas présent dans les cellules normales. Toutefois, afin de visualiser plus d’événements les au sein de la cellule, il est nécessaire de transférer le ROI fluorescent étiqueté dans le microscope électronique. Pour corrélatif microscopie photonique et électronique (CLEM), les images au microscope photonique et au microscope électronique sont généralement corrélés à l’aide des billes de latex fluorescentes ou points quantiques sur EM finder grilles12. Les particules d’étiquetage doivent être de densité électronique élevée en plus de la fluorescence. Ils peuvent avec précision et fiabilité corréler les positions entre les deux images. En outre, en confirmant la zone étiquetée avec la microscopie de cryo-lumière, chevauchement complet de retour sur investissement peut être réalisé entre les deux microscopes. Lors de la caractérisation des événements structurels plus détaillées dans la compaction de l’ADN, ces particules et microscopie de cryo-light sera un outil indispensable pour une corrélation plus robuste et précis à l’avenir.
Cet article montre comment caractériser la structure transitoire de compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par une combinaison de culture synchrone, de microscopie par fluorescence et de tomographie cryo-électronique haute tension. Ce protocole met l’accent sur l’observation de l’ADN compacté. En combinant cette méthode avec d’autres nouvelles technologies mentionnées ci-dessus, il sera possible d’étudier le processus de compactage d’ADN plus en détail, et méthodes convenablement modifiées sont largement applicables à d’autres événements structurels dynamiques dans les bactéries.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Tammo Reisewitz pour une lecture critique du manuscrit et les deux Mako Hayashi et Sayuri Hagiwara pour la culture attentive et l’observation des cyanobactéries, Yoshitaka Kimori pour traitement d’image, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki et Miyoko Nagayoshi pour aider avec la segmentation des structures. Ce travail a été soutenu par le programme d’étude Collaborative de l’Institut National des Sciences physiologiques (pin) à Y.K.
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |