Questo protocollo viene descritto come visualizzare la compattazione DNA transitoria nei cianobatteri. Coltivazione sincrono, monitoraggio di microscopia di fluorescenza, congelamento rapido e alta tomografia di cryo-elettrone di tensione sono usati. Un protocollo per queste metodologie è presentato, e sono discussi gli sviluppi e le applicazioni future.
Questo protocollo viene descritto come visualizzare la compattazione DNA transitoria nei cianobatteri. Compattazione del DNA è un evento drammatico citoplasmico recentemente risultato in alcuni cianobatteri prima divisione cellulare. Tuttavia, a causa delle dimensioni di grandi cellule e il carattere transitorio, è difficile indagare la struttura in dettaglio. Per superare le difficoltà, in primo luogo, compattazione del DNA è riproducibile prodotto in cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 da cultura sincrono utilizzando 12 h ogni ciclo luce/buio. In secondo luogo, compattazione del DNA è monitorata mediante microscopia a fluorescenza e catturato mediante congelamento rapido. In terzo luogo, la struttura dettagliata del DNA compattato celle viene visualizzata in tre dimensioni (3D) tramite tomografia del cryo-elettrone ad alta tensione. Questo insieme di metodi è ampiamente applicabile per indagare strutture transitori in batteri, ad esempio la divisione cellulare, segregazione del cromosoma, infezione dei fagi ecc., che sono monitorati mediante microscopia a fluorescenza e visualizzate direttamente da tomografia di Cryo-elettrone a intervalli di tempo appropriati.
Compattazione del DNA è un evento drammatico citoplasmatico che è stato individuato in alcuni cianobatteri. Quando Synechococcus elongatus è stato coltivato sotto 12 h ogni ciclo luce/buio, DNA è apparso condensata alla fine del periodo di luce, che era chiaramente diverso dalla sua apparizione nel momento punti1. È stato suggerito che questo processo è controllato da un orologio circadiano basato sul Kai proteine2. Seki et al hanno riferito che il DNA colorato con Hoechst 33342 è stato compattato in cellule di S. elongatus verso la fine del periodo di luce e ha mostrato una rod-forma ondulata sotto un microscopio a fluorescenza. Il DNA compattato, poi separato in due al centro dell’asta come la cellula diviso e infine tornò a una normale distribuzione uniforme in ogni cellula figlia3. Tuttavia, la natura transitoria e grandi dimensioni per microscopia elettronica ostacolato analisi strutturale. Murata et al combinato diversi metodi, tra cui cultura sincrono, microscopia a fluorescenza, congelamento rapido e ad alta tensione cryo-tomografia elettronica (cryo-HVET) ed è riuscito a individuare la struttura di compattazione DNA transitoria, compresa la cinetica di polifosfato corpi (PPBs)4. Il manoscritto fornisce spiegazione visiva di un materiale così difficile in dettaglio combinando le procedure sperimentali.
S. elongatus ha una forma di capsula, una lunghezza di 2 a 5 µm, una larghezza di circa 0,5 µm e la perfetta compattazione DNA appare in cellule viventi solo per un tempo molto breve. Di conseguenza, i cambiamenti strutturali che si verificano la compattazione DNA cianobatterica erano sconosciuti in dettaglio. Per studiare queste strutture da microscopia elettronica, è necessario superare due principali problemi tecnici. Uno è l’osservazione di un esemplare di spesso del batterio intero al vicino circostanze natali, e l’altro è il fissaggio rapido di una struttura dinamica. Per quanto riguarda il primo problema, il percorso libero medio (iMFP) anelastico di elettroni dipende la tensione accelerare del microscopio elettronico5. In un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di 300 kV, è inferiore a 350 nm. Ad esempio, quando un cianobatterio ghiaccio incorporato (esemplare spessore ≈ 600 nm) è osservato a 200kV TEM (≈ iMFP 250 nm), le strutture all’interno delle cellule sono difficili da osservare. Per contro, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) può dare e immagine della struttura citoplasmatica in tutta la cellula (Figura 1). In questo protocollo, come una parte della soluzione, un microscopio elettronico ad alta tensione (HVEM) a una tensione di accelerazione di 1 MV è stato impiegato. Tuttavia, i servizi che implementano HVEM sono limitati in tutto il mondo. Possibili soluzioni alternative inoltre sono discussi nella sezione discussione. Il secondo problema è stato risolto da cryo-microscopia elettronica (cryo-EM). Si tratta di un potente strumento per la visualizzazione dinamica delle strutture a vicino a circostanze natali, dove il campione è congelare rapidamente in etano liquido utilizzando un dispositivo di congelamento rapido, e il momento congelato è osservato direttamente con un minimo di modifiche6. Combinando con tomografia, uno snapshot di strutture tridimensionali (3D) può essere ricostruito dalla inclinazione serie7. In questo esperimento, compattazione del DNA è stata riprodotta in s. elongatus utilizzando sincrono cultura ciclo di meno di 12 h ogni luce/buio, e la tempistica del congelamento del campione è stata determinata mediante monitoraggio sotto un microscopio a fluorescenza.
Gli approcci descritti qui sono ampiamente applicabili allo studio delle strutture dinamiche in cellule batteriche, ad esempio la divisione cellulare, segregazione del cromosoma ed infezione dei fagi e hanno un potenziale per aprire nuove vie nella ricerca microbiologica.
Abbiamo presentato una sequenza di protocolli per la visualizzazione transitoria compattazione del DNA nei cianobatteri. Il concetto di base è simile a quella del correlativo luce e microscopia elettronica (CLEM)12. Inoltre, in questo metodo, live cianobatteri sono stati monitorati mediante microscopia a fluorescenza, congelati rapidamente sulle griglie di EM e visualizzati direttamente con tomografia cryo-elettrone ad alta tensione. Come una prima applicazione, la struttura dettagliata del DNA compattato cellule batteriche è stato correttamente visualizzato in 3D. Attualmente, questa procedura è specifica per questo argomento, ma essa si applicherà più estesamente, con metodologia modificata in alcuni casi. Qui, i vantaggi, i limiti e le possibilità future di questo metodo sono discussi.
Uno dei vantaggi di questo metodo è la visualizzazione 3D di tutta la cella. 1 MV HVEM visualizzati correttamente la dinamica struttura degli organelli sottocellulari nel DNA compattato le cellule. Tuttavia, la struttura fine all’interno di cellule normali non si distinguevano a causa del contrasto dell’immagine in basso. Aumentando anelastica e quantistico negli esemplari di spessi sfoca l’immagine13. Perdita zero e la maggior parte-probabile-perdita immagine filtro da un filtro di energia può migliorare il contrasto dell’immagine riducendo la dispersione anelastica14,15, ma non funzionerà per gli esemplari più spessi di iMFP. I picchi di perdita zero e la maggior parte-probabile-perdita drasticamente diminuiscono con spessore provini. È particolarmente difficile ottenere un rapporto segnale-rumore sufficiente per i campioni di ghiaccio incorporato sensibile dell’elettrone. Murata et al hanno dimostrato che la trasmissione scansione 1MV dà di microscopia (STEM) maggiore contrasto di immagine rispetto a un’immagine di campo luminoso in plastica incorporato di cellule di lievito con 5 µm di spessore, dove il contrasto dell’immagine è dato principalmente da contrasto ampiezza13 . Tuttavia, si prevede che l’effetto di trascinamento danno il maggiori elettroni accelerati crea un’altra limitazione alla dose di irradiazione per danni sensibili cryo-campioni16. L’applicazione di Volta e Zernike fase piastre17,18 per HVEM può essere in grado di ridurre i danni secondari riducendo la dose totale in futuro. Un’altra limitazione all’utilizzo HVEM per spessi esemplari deriva dal fatto che le strutture di utente che forniscono HVEM sono scarse in tutto il mondo.
Utilizzando una metodologia alternativa di osservare esemplari di spessi, tomografia di cryo-staminali a 300 kV ha dimostrato immagini ad alto contrasto su campioni congelati-idrato con spessore superiore a diverse centinaia di nanometri19. Per recuperare il contrasto di fase in cryo-staminali, microscopia elettronica pthychographic è stato introdotto anche, in cui la piastra di fase nella lente condensatore traspone una diffrazione modulato in fase a un pixelated detector 2D20. Le immagini vengono recuperate mediante calcolo da più le diffrazioni. Per cryo-imaging 3D veloce e diretto di grande nativo congelati campioni, cryo-FIB-SEM può anche essere usato21, dove seriale sezionamento con un fascio ionico focalizzato e bloccare viso imaging viene applicati per imaging completamente idratata campioni congelati. Anche se queste tecnologie ampliare la gamma di osservazione di campioni biologici, è difficile trovare il percorso di destinazione dei batteri, ad esempio etichettato come batteri, perché l’obiettivo è completamente sotto il ghiaccio e non può essere identificato prima di tagliare.
Compattazione del DNA produce una struttura distinta nei cianobatteri. DNA compattato cellule sono prontamente distinto anche senza essere macchiato a causa di una distorsione di grande densità all’interno delle cellule che non è presente nelle cellule normali. Tuttavia, al fine di visualizzare altri eventi locali all’interno della cellula, è necessario trasferire il ROI fluorescente contrassegnato nel microscopio elettronico. Per correlativo luce e microscopia elettronica (CLEM), immagini del microscopio ottico e microscopio elettronico immagini sono generalmente correlati utilizzando granuli di lattice fluorescente o punti quantici su EM finder griglie12. Le particelle di etichettatura devono essere di densità dell’elettrone alta oltre a fluorescenza. Essi possono correlare con precisione e in modo affidabile le posizioni tra le due immagini. Inoltre, confermando l’area con etichetta con microscopia crio-luce, completa sovrapposizione del ROI può essere raggiunto tra i due microscopi. Quando che caratterizza eventi più dettagliati strutturali nella compattazione del DNA, queste particelle e cryo-luce microscopio sarà uno strumento indispensabile per una correlazione più robusto e preciso in futuro.
In questo articolo viene illustrato come caratterizzare la struttura transitoria di compattazione del DNA nei cianobatteri da una combinazione di cultura sincrono, microscopia a fluorescenza e tomografia cryo-elettrone ad alta tensione. Questo protocollo si concentra sull’osservazione del DNA compattato. Combinando questo metodo con altre nuove tecnologie di cui sopra, sarà possibile studiare il processo di compattazione del DNA in dettaglio e metodi opportunamente modificate sono ampiamente applicabili agli altri eventi dinamici strutturali nei batteri.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Tammo Reisewitz per lettura critica del manoscritto e sia Mako Hayashi e Sayuri Hagiwara per coltivazione attenta e l’osservazione di cianobatteri, Yoshitaka Kimori per elaborazione di immagini, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki e Miyoko Nagayoshi per aiutare con la segmentazione delle strutture. Questo lavoro è stato supportato dal programma di studio collaborativo dell’Istituto Nazionale Scienze fisiologiche (NIPS) per Y.K.
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |