Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.
Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. DNA sıkıştırma son zamanlarda bazı Siyanobakteriler hücre bölünmesi önce gerçekleşmesi için bulundu dramatik sitoplazmik olaydır. Ancak, büyük hücre boyutu ve geçici karakteri nedeniyle yapısı ayrıntılı araştırmak zordur. Zorlukları aşmak için ilk olarak, DNA sıkıştırma tekrarlanarak cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 12 h her ışık/karanlık döngüsü kullanılarak zaman uyumlu kültür tarafından üretilmektedir. İkinci olarak, DNA sıkıştırma floresans mikroskobu tarafından izlenen ve hızlı donma tarafından ele geçirdi. Üçüncü olarak, hücre DNA’ın ayrıntılı yapısı sıkıştırılmış yüksek gerilim cryo-elektron tomografi tarafından üç boyutlu (3D) olarak görüntülenir. Bu yöntemler bakteri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon, fajının enfeksiyon vbgeçici yapılarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir ayarlanır., hangi floresans mikroskobu tarafından izlenen ve doğrudan tarafından görüntülenmiştir Cryo-elektron tomografi uygun zaman noktalarda.
DNA sıkıştırma bazı Siyanobakteriler olduğu belirlendi dramatik bir sitoplazmik olaydır. Ne zaman Synechococcus elongatus altında 12 h her ışık/karanlık döngüsü, görünümü diğer zaman açıkça farklı ışık süresi kısaltılmış göründü DNA kültürlü1puan. Bu işlem tarafından Kai proteinler2dayalı bir sirkadiyen saat denetlenir sürülmüştür. Seki ve ark. Höchst 33342 ile lekeli DNA ışık döneminin sonuna doğru S. elongatus hücrelerdeki sıkıştırılmış ve floresan mikroskop altında dalgalı bir çubuk şekli gösterdi bildirdin. Sıkıştırılmış DNA sonra çubuk ortasındaki ikiye bölünmüş ve nihayet her kızı hücre3normal tekdüze dağılım için döndürülen hücre olarak ayrılmış. Ancak, onun geçici doğası ve büyüklüğü elektron mikroskopi için yapısal analizi engellemiştir. Murata vd. kombine zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler gerilim elektron cryo-tomografi (cryo-HVET) ve geçici DNA sıkıştırma, yapısını belirlenmesinde başarılı oldu polifosfat organları (PPBs)4kinetik dahil olmak üzere. El yazması deneysel prosedürler birleştirerek görsel zor bir malzeme ayrıntılı açıklamasını sağlar.
S. elongatus kapsül bir şekli vardır, canlı hücreler çok kısa bir süre için sadece 2-5 µm, 0.5 µm hakkında bir genişliği ve mükemmel DNA sıkıştırma uzunluğu görünür. Bu nedenle, siyanobakteriyel DNA sıkıştırma içinde meydana gelen yapısal değişiklikler ayrıntılı olarak bilinmiyordu. Bu yapıların elektron mikroskobu tarafından araştırmak için iki ana teknik sorunların üstesinden gelmek gereklidir. Bir yerel koşullar yakınındaki bakteri bütün kalın bir örnek gözlem ve diğer dinamik bir yapısı hızlı fiksasyonu. İlk sorun gelince, esnek olmayan ortalama özgür keçiyolu (iMFP) elektron elektron mikroskobu5hızlanan voltajı bağlıdır. 300 transmisyon elektron mikroskobu (TEM) içinde kV, sanki daha az 350 nm. Örneğin, bir buz gömülü cyanobacterium zaman (numune kalınlığı ≈ 600 nm) 200kV TEM görülmektedir (iMFP ≈ 250 nm), hücre içindeki yapıları gözlemlemek zordur. Buna karşılık, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) vermek ve görüntü hücre (Şekil 1) boyunca sitoplazmik yapısının. Bu iletişim kuralı ‘ belgili tanımlık eriyik, 1 hızlanan bir gerilim, bir yüksek gerilim elektron mikroskobu (HVEM) bir parçası olarak MV istihdam. Ancak, HVEM uygulamak İmkanlar dünya çapında sınırlıdır. Olası alternatif çözümler de tartışma bölümde ele alınmıştır. İkinci sorun cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) tarafından çözüldü. Bu dinamik yapılar yerel koşullar, nerede örnek sıvı etan hızlı dondurucu cihaz kullanarak hızla dondurulur ve donmuş an doğrudan değişiklikler6minimum görülmektedir yakınındaki görüntülenmesi için güçlü bir araçtır. Tomografi ile birleştirerek, üç boyutlu (3D) yapıları bir anlık görüntü tilt serisi7‘ den yeniden olabilir. Bu deneyde, DNA sıkıştırma zaman uyumlu kültür altında 12 h her açık/koyu döngüsü kullanarak elongatus S. yeniden oluşturulmalı ve numune dondurulması zamanlaması floresan mikroskop altında izleyerek tespit edildi.
Burada açıklanan yaklaşım yaygın olarak bakteri hücreleri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon ve faj enfeksiyon dinamik yapıları incelenmesi için geçerlidir ve mikrobiyolojik araştırmada yeni yollar açmak için bir potansiyele sahiptir.
Biz bir sıra geçici DNA sıkıştırma Siyanobakteriler içinde görüntülenmesi için iletişim kurallarının sundu. Temel kavram bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM)12benzemektedir. Buna ek olarak, bu yöntemde, canlı Siyanobakteriler floresans mikroskobu tarafından izlenen, hızla EM ızgaralar donmuş ve doğrudan yüksek gerilim cryo-elektron tomografi ile görüntülenir. İlk uygulama, DNA’ın ayrıntılı yapısı bakteri hücreleri sıkıştırılmış gibi başarılı bir şekilde 3D görselleştirildiği. Şu anda, bu konuya özel bir işlemdir ama daha kapsamlı, bazı durumlarda değiştirilmiş metodolojisi ile uygulanacaktır. Burada, avantajları, sınırlamaları ve bu yöntemi gelecekteki olanakları ele alınmıştır.
Bu yöntemin avantajları, biri bütün hücre 3D görselleştirme. 1 MV HVEM başarıyla görüntülenir Dinamik DNA hücre altı organelleri yapısını sıkıştırılmış hücreleri. Ancak, normal hücrelere ince yapısı nedeniyle düşük görüntü kontrastı ayırt edilebilir değil. Esnek olmayan artan ve kalın numuneler birden çok saçılma bulanıklaştırır görüntü13. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı görüntü bir enerji filtresi yoluyla filtre elastik saçılma14,15azaltarak görüntü kontrastı artırabilir ama numuneler iMFP kalın için çalışmaz. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı doruklarına numune kalınlığı ile büyük ölçüde azaltır. Elektron hassas buz gömülü numuneler için yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek özellikle zordur. Murata vd göstermiştir bu 1MV tarama iletim plastik parlak alan görüntüde daha yüksek görüntü kontrastı Maya hücreleri 5 µm kalınlık ile gömülü mikroskobu (kök) verir nerede görüntü kontrastı öncelikle genlik kontrast13 tarafından verilir . Ancak, daha yüksek hızlandırılmış elektron Knock hasar etkisi zarar duyarlı cryo-numune16için ışınlama doz için başka bir sınırlama oluşturur bekleniyor. Faz plaka17,18 Volta ve Frits kullanma HVEM için toplam doz gelecekte azaltarak Knock zarar azaltmak mümkün olabilir. HVEM için kalın örnekler kullanarak başka bir sınırlama HVEM sağlamak Kullanıcı Özellikleri dünya çapında kıt olduğu gerçeği gelir.
Kalın numuneler, cryo-kök tomografi vasıl 300 gözlemlemek için alternatif bir yöntem kullanarak kV yüksek kontrastlı görüntüler dondurulmuş-sulu numuneler üzerinde birkaç yüz nanometre19aşan kalınlı¤ında göstermiştir. Cryo-kök faz kontrast almak için elektron pthychographic mikroskobu Ayrıca, faz plaka kondansatör objektif bir faz modülasyonlu kırınım pixelated 2D dedektörü20transposes girmiştir. Görüntüleri birden çok diffractions hesaplamadan tarafından alınır. Doğrudan ve hızlı 3D cryo-görüntüleme büyük yerli cryo-yalan-SEM örnekleri, donmuş Ayrıca kullanılan21, seri nerede ile odaklı iyon kiriş kesit ve yüz görüntüleme engellemek için görüntüleme tamamen donmuş numuneler sulu için uygulanır. Bu teknolojiler Biyolojik örneklerin görüş yelpazesini genişletmek, bakteri, hedef konumunu bulmak zor olsa da Örneğin etiketli bakteri, çünkü hedef tamamen buz altında ve kırpma önce tanımlanamıyor.
DNA sıkıştırma Siyanobakteriler farklı bir yapıda üretir. DNA sıkıştırılmış hücreleri bile normal hücrelerde mevcut değil bir büyük yoğunluk önyargı hücrelerindeki nedeniyle lekeli olmadan kolayca ayırt edilirler. Ancak, hücre içinde daha fazla yerel etkinlikler görselleştirmek için fluorescently etiketli ROI elektron mikroskobu aktarmak gereklidir. Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için ışık mikroskobu görüntüler ve elektron mikroskobu görüntüleri genellikle EM Bulucu ızgaralar12tarihinde floresan lateks boncuk veya kuantum nokta kullanarak correlated. Etiketleme parçacıklar yüksek elektron yoğunluğu floresans yanı sıra olması gerekir. Doğru ve güvenilir bir şekilde iki görüntü arasında pozisyonlar ilişkilendirmek. Ayrıca, etiketli alanı cryo-ışık mikroskobu ile teyit ederek, Roi tam örtüşme arasında iki mikroskoplar elde edilebilir. Bu parçacıklar ve cryo-ışık mikroskobu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı yapısal olaylar karakterize, daha sağlam ve doğru bir ilişki içinde belgili tanımlık gelecek için vazgeçilmez bir araç olacaktır.
Bu makalede, siyanobakteriler DNA sıkıştırma geçici yapısını zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu ve yüksek gerilim cryo-elektron tomografi birleşimiyle karakterize gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı sıkıştırılmış DNA gözlem üzerinde duruluyor. Bu yöntem yukarıda bahsedilen diğer yeni teknolojilerle birleştirildiğinde, bu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı süreci araştırmak mümkün ve uygun değiştirilmiş yöntemleri yaygın olarak bakteri diğer dinamik yapısal olaylara tabidir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Tammo Reisewitz el yazması ve hem Mako Hayashi ve Sayuri Hagiwara dikkatli ekimi için eleştirel okuma ve Siyanobakteriler, görüntü işleme için Yoshitaka Kimori, Chihong şarkı, Naoyuki Miyazaki ve Miyoko gözlem için teşekkür ederiz Nagayoşi yapıları bölümleme ile yardım ettiğin için. Bu eser için Fizyolojik Bilimler (NIPS) Y.K. için ulusal Enstitü ortak çalışma programı tarafından desteklenen
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |