En metode for måling av Salivary kjortelen funksjon i mus
Summary
Salivary kjortelen hypofunction er en hyppig konsekvens av autoimmun sykdom og stråling terapi. Reproduserbar evaluering av salivary kjortelen funksjon i musen modeller av disse sykdommene er en teknisk utfordring. Her beskrives en enkel metode for nøyaktig og reproduserbar måling av spytt produksjonen hos mus.
Abstract
Pasienter med Sjögrens syndrom, en autoimmun sykdom som påvirker exocrine kjertler, utvikle salivary kjortelen betennelse og har redusert spytt produksjonen. Tilsvarende er spytt produksjonen sterkt svekket i pasienter som får strålebehandling for hode og nakke kreft. Gnager modeller, utviklet for å etterligne disse klinisk betingelser rette en forståelse av sykdommen patogenesen og tillate utviklingen av nye strategier. Evnen til å nøyaktig reproduserbar og gjentatte ganger måle salivary kjortelen funksjon i dyremodeller er derfor kritisk. Bygge på prosedyrer tidligere beskrevet i litteraturen, ble en metode utviklet som oppfyller disse kriteriene, og ble brukt til å evaluere salivary kjortelen funksjon i mus. En ekstra fordel av denne nye metoden er at det er lett mestrer, og har litt mellom operatører variant. Salivary kjortelen funksjonen evalueres som beløp (vekt eller volum) eller hastigheten (mL/min) av spytt produsert i svar til pilokarpin stimulering. Samlet spytt er en god kilde for analyser proteininnhold, immunglobulin konsentrasjoner og andre biomolecules.
Introduction
Spyttkjertler produsere spytt som svar på en rekke nevrologiske og mekanisk stimuli1. Stimuli er gjennomført sympatisk og parasympatiske nervesystemet til adrenerge og cholinergic receptors i kjertel. Pilokarpin er en cholinergic, para-sympathomimetic agent som virker hovedsakelig på muscarinic reseptorene. I det salivary kjortelen induserer det produksjon av spytt ved å handle på muscarinic acetylcholin reseptor M31. Spytt produksjonen etter pilokarpin administrasjon er en indikator på muligheten av spyttkjertler å svare til stimulering og er ofte brukt som et mål på salivary kjortelen funksjon.
Nøyaktig måling av spytt produksjonen er kritisk i studiet av salivary kjortelen sykdommer inkludert Sjögrens syndrom2 og stråling skader etter hode og nakke kreft behandling3. Flere metoder har blitt utviklet for å måle spytt produksjonen i gnagere. Disse inkluderer direkte cannulation av excretory salivary duct4, samling av spytt fra munnhulen under vakuum5og samlingen med glass kapillærene6 eller brønnene7,8, 9. direkte cannulation på salivary røret gir den mest nøyaktige og ren spytt. Men dette er en teknisk utfordrende prosedyre, og potensialet for skade ductal utelukker repeterende spytt samlinger fra samme dyret. Samle spytt under vakuum kan føre til variable resultater på grunn av tørking av spytt fra røret. Dette er ytterligere overdrevet i mus med redusert spyttsekresjon. Glass kapillærene tillate innsamling av spytt for senere analyser, men endringer i viskositet av spytt utskilles i syke staten forhindrer effektiv fylling av av kapillær. Videre kan forsøk å feie munnhulen å samle gjenværende spytt føre til skade. Pipetter metoden gir komplett samling, og for den samme operatøren, er det bemerkelsesverdig enhetlige eksperimenter. Men for ukjente årsaker viser denne metoden betydelig variasjon mellom forskjellige operatører. Derfor for å tillate riktig sammenligninger, blir det viktig at den samme operatøren utfører alle eksperimenter relatert til et bestemt prosjekt. Klart, dette er en stor ulempe for et laboratorium.
For å overvinne disse problemene, utviklet en prosedyre som kombinerer spytt samling metoder brukt for mennesker og gnagere. Metoden vattpinne beskrevet nedenfor for å måle pilokarpin-indusert spytt volum er enkelt, reproduserbare, ikke påvirket av operatøren, og kan utføres flere ganger i samme dyret. I tillegg lar den samle spytt for senere analyser av proteiner, immunglobuliner eller andre biomolecules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spytt produksjonen er en kompleks prosess og er påvirket av mange faktorer. Måle salivary kjortelen funksjon i forsøksdyr kan derfor være en utfordring. En ekstra utfordring er at gjentatte målinger av salivary kjortelen funksjon i samme dyret er nødvendig å etablere utbruddet av sykdommen eller å demonstrere utvinningen behandling.
Vattpinne metoden beskrevet i denne rapporten er teknisk enkelt å utføre med flere alternativer for å representere dataene. Resultatene er reproduserbar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health, National Institute for Dental og Craniofacial forskning (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Riferimenti
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
