Fostrets mus hjärt Imaging använder ett högfrekvent ultraljud (30 / 45MHZ)
Summary
Hög frekvens ultraljudsundersökningar av fostrets musen har förbättrats imaging upplösning och kan ge exakta noninvasiv karakterisering av hjärt utveckling och strukturella brister. Protokollet beskrivs häri är utformad att utföra realtid fostrets möss ekokardiografi i vivo.
Abstract
Medfödda hjärtfel (CHDs) är den vanligaste orsaken till barndom sjuklighet och förtida dödlighet. Prenatal upptäckt av underliggande molekylära mekanismer för CHDs är avgörande för att uppfinna nya förebyggande och terapeutiska strategier. Mutant mus-modeller är kraftfulla verktyg att upptäcka nya mekanismer och miljöbelastning modifierare som driver hjärt utveckling och deras potentiella förändring i CHDs. Ansträngningar för att upprätta kausalitet av dessa förmodade bidragsgivare har varit är begränsat till histologiska och molekylära studier på icke-survival djurförsök, i vilken övervakning de viktiga fysiologiska och hemodynamiska parametrarna dock ofta frånvarande. Levande bildteknik har blivit ett viktigt verktyg för att fastställa etiologin av CHDs. I synnerhet ultraljudsundersökningar kan användas prenatalt utan kirurgiskt utsätta fostren, gör det möjligt att upprätthålla deras baslinjen fysiologi samtidigt övervaka effekterna av miljömässiga stress på de hemodynamiska och strukturella aspekterna av hjärtats kammare utveckling. Häri, använder vi högfrekvent ultraljud (30/45) systemet för att undersöka det kardiovaskulära systemet i fostrets möss vid E18.5 i livmodern vid baslinjen och i svar på prenatal hypoxi exponering. Vi demonstrera genomförbarheten av systemet för att mäta hjärtats kammare storlek, morfologi, kammarfunktion, fostrets hjärtfrekvens, och navelsträngen artären flöde index och deras förändringar i fostrets möss som utsätts för systemisk kronisk hypoxi i livmodern i real tid.
Introduction
Medfödda missbildningar av hjärtat är heterogena strukturella fel som uppstår under tidig hjärt utveckling. Nuvarande tekniska framsteg av operativa förfaranden har lett till betydande förbättringar i överlevnaden av spädbarn med CHDs1,2. Men är livskvalitet ofta nedsatt sekundärt till långvarig sjukhusvistelse och behov för stegvis kirurgisk reparation förfaranden1,2,3,4,5. Prenatal upptäckt av underliggande molekylära mekanismer för CHDs är avgörande för att planera tidiga insatser, att genomföra nya förebyggande strategier, och att förbättra livslångt resultat6,7.
Även om flera genetiska och miljömässiga faktorer har varit inblandade i CHDs patogenes, fastställa kausalitet är fortfarande ett ouppfyllt behov att förbättra diagnostiska, terapeutiska och förebyggande strategier1,8,9 ,10,11,12. Dessutom öppnar undersöker roller i livmodern stressfaktorer och epigenetiska modifierare nya arenor för framtida utredningar11,12. Det senaste decenniet har verkligen upplevt snabba framsteg i nästa generations sekvensering teknik inklusive single nucleotide polymorphism (SNP) microarray, hela exome sekvensering och genome-wide metylering studier, deras utnyttjande för att studera den genetiska orsakerna till komplexa sjukdomar, inklusive CHDs1,8,9,10,11 banar väg att identifiera nya mutationer och genetiska varianter som ännu inte har testade för deras patogenicitet i lämplig djurmodeller.
Bland de olika sjukdomen modellsystem är musen djurmodell av val, inte bara för att undersöka mekanismer för CHDs under tidig cardiogenesis13,14,15,16, men också att belysa deras inverkan på hjärtats kammare mognad och funktion vid sendräktighet i prenatal och perinatal stressfaktorer. Därför utför i vivo fenotypisk karakterisering av ett mutant fostrets mus hjärta, under både tidiga och sena stadier av utveckling, är avgörande för att förstå rollen som dessa genetiska variationer och miljöfaktorer på hjärt utveckling, och potentiella framtida påverkan på kammaren särskilda mognad processer hos möss.
Tidig upptäckt och korrekt diagnos av hjärtfel under utveckling är avgörande för interventionell planering17,18. Att vara säker, enkel, bärbar och repeterbara, har fostrets sonography verkligen blivit standard bildteknik för hjärt utvärdering i kliniken. Fostrets cirkulation bedömning med hjälp av Doppler ultraljud har använts i klinisk praxis inte bara för att upptäcka hjärtfel, men också att upptäcka vaskulära avvikelser, moderkakan insufficiens och intrauterin tillväxt begränsning och bedöma fostrets välbefinnande svar på Utero förolämpningar inklusive hypoxemi, moderns sjukdom och drog toxicitet17,18. Parallellt till sitt värde vid utvärdering av mänskliga defekter och sjukdomar, har ultraljud bedömning av fostrets möss vunnit allt större nytta i experimentell inställningar19,20,21,22, 23. I synnerhet tillåter fostrets hjärta ultraljud (ekokardiografi) sekventiella i vivo visualisering av utveckla hjärtat. Många experimentella studier har använt ultraljud-imaging teknik för att observera kardiovaskulära fosterutveckling hos transgena fostrets möss. Doppler ultraljud har varit särskilt användbar att klarlägga patofysiologiska parametrarna, såsom flödesmönster i fostrets cirkulation under fysiologiska utmaningar eller sjukdom villkor10,19. Både människor och djur, kan onormal flöde eller syre blodtillförseln till fostret resultera från olika förhållanden som kan störa fostrets miljö i livmodern och påverkar den fetoplacental axeln, inklusive placenta avvikelser, maternell hypoxi, graviditetsdiabetes och farmaceutiskt inducerad vaskulär sammandragning15,22. Därför att att upprätta standardiserade metoder för att utföra Doppler ultraljud på fostrets möss oerhört bemyndigar framtida studier av CHDs genom att underlätta övervakning flödesmönster och nyckel hemodynamiska index av kardiovaskulära kretsar under olika stadier av hjärt utveckling i genetiska musmodeller.
Hög frekvens ultraljud har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att mäta de utvecklingsmässiga och fysiologiska parametrarna av hjärt-kärlsystemet i musmodeller och mänskliga sjukdomar18. Denna teknik har varit förfinas ytterligare under de senaste åren. Vi och andra forskare har visat genomförbarheten av detta system för ultrahög frekvens ultraljud studier på fostrets mus hjärta15,19,20,21,22 ,23. Systemet är utrustat med Doppler färgmappning flöde och linjär array givare som genererar tvådimensionell, dynamiska bilder med hög frekvens (30 till 50 MHz) bildrutehastigheter. Dessa fördelar, jämfört med låg frekvens ultraljud system och den tidigare generationen högfrekvent ultraljud21,22, tillhandahålla nödvändig känslighet och upplösning för ingående bedömning av den fetala cirkulatorisk system, inklusive omfattande karakterisering av hjärtat strukturer, kammare funktion och flöde index för fostrets möss i experimentell inställningar. Häri, beskriva vi metoder för att utföra snabb bedömning av cardiopulmonary cirkulation och feto-placenta omsättning till embryonala dag E18.5 i vivo genom att använda en hög frekvens system. Vi valde en 30/45 MHz-givare som ger en axiell upplösning av ungefärligt 60 µm och en lateral upplösning på 150 µm. Dock kan en högre frekvens givare (40/50 MHz) väljas för att analysera tidigare utvecklingsstadier genom att följa en liknande metod. Det valda M-läget låter visualisering av vävnader i rörelse på hög temporal upplösning nivåer (1.000 bildrutor/s). Slutligen, vi demonstrera genomförbarheten av hög ultraljud för detaljerad omfattande fenotypisk karakterisering av fostrets kardiovaskulära hemodynamisk status och funktion hos möss vid baseline och svar på prenatal hypoxi stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kardiovaskulära missbildningar och sjukdomar påverkas avsevärt av genetiska faktorer och miljöfaktorer19. Vi har tidigare visat en betydande inverkan av maternell kalori begränsning, inleddes under andra trimestern, feto-placenta cirkulatoriska flödet och fostrets hjärtfunktion9.
Prenatal hypoxi är en annan vanlig stressfaktor under fosterutvecklingen som oerhört kan påverka feto-placenta fysiologi och cirkulationssystemet. Effekterna a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Djurfysiologi kärnan, avdelningen för molekylär medicin vid UCLA för att tillhandahålla teknisk support och öppen tillgång till Vevo 2100 ultraljud biomikroskopi (UBM) systemet. Denna studie stöddes av NIH/barn hälsa Research Center (5K12HD034610/K12), UCLA-barnens Discovery Institute och idag och i morgon Children’s Fund, och David Geffen skola av medicin forskning Innovation award till M. Touma.
Materials
| Vevo 2100 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | N/A | High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA |
| inbred mice (c57/BL6) | Charles River Laboratories | N/A | Inbread wild type mouse strain |
Riferimenti
- Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
- Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
- Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
- Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
- Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection?. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (10), 664-672 (2013).
- Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140 (6), 1245-1250 (2010).
- Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57 (8), 402-413 (2014).
- Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
- Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
- LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9 (4), 320-329 (2016).
- Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498 (7453), 220-223 (2016).
- Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128 (5), 1116-1125 (2016).
- Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127 (6), 1101-1104 (2006).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
- Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157 (10), 4041-4054 (2016).
- Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
- Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72 (1), 54-61 (2017).
- He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71 (6), 699-708 (2016).
- Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116 (2 Pt 1), 316-322 (2016).
- Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
- Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
- Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46 (16), 602-614 (2014).
- Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22 (12), 1649-1655 (2015).
- Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10 (2), 73-85 (2010).
- Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33 (11), 1167-1173 (2010).
