विवो फाइबर-युग्मित प्री-क्लिनिकल कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग एंडोमाइक्रोस्कोपी (पीसीएलई) में जागृत चूहों में हिप्पोकैम्पल केशिकाएं
Summary
जबकि मल्टीफोटॉन इमेजिंग केवल ऊतक की सतह से सीमित गहराई पर प्रभावी है, पीसीएलई के माध्यम से किसी भी गहराई पर 3 μm रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करना संभव है। यहां, हम आईसीटीऔर जंगली प्रकार के चूहों के हिप्पोकैम्पस में माइक्रोवस्कुलर गतिशीलता को मापने के लिए पीसीईएल इमेजिंग का संचालन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य भित्ति कोशिकाओं द्वारा संचालित दौरे के दौरान केशिका रक्त प्रवाह प्रभावों को स्पष्ट करने के लिए अपने विशिष्ट अनुप्रयोग में फाइबर-ऑप्टिक-बंडल-युग्मित पूर्व-नैदानिक कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग एंडोमाइक्रोस्कोपी (पीसीएलई) का वर्णन करना है। इन विट्रो और विवो कॉर्टिकल इमेजिंग से पता चला है कि पेरिसाइट्स द्वारा संचालित केशिका कसना स्वस्थ जानवरों में कार्यात्मक स्थानीय तंत्रिका गतिविधि के साथ-साथ दवा के आवेदन से उत्पन्न हो सकता है। यहां, किसी भी ऊतक गहराई (विशेष रूप से हिप्पोकैम्पस में) पर मिर्गी में तंत्रिका अध: पतन में माइक्रोवस्कुलर गतिशीलता की भूमिका निर्धारित करने के लिए पीसीई का उपयोग करने के तरीके पर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। हम एक सिर संयम तकनीक का वर्णन करते हैं जिसे जागृत जानवरों में पीसीई रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया गया है, ताकि तंत्रिका गतिविधि पर एनेस्थेटिक्स के संभावित दुष्प्रभावों को संबोधित किया जा सके। इन तरीकों का उपयोग करके, मस्तिष्क की गहरी तंत्रिका संरचनाओं में कई घंटों में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और इमेजिंग रिकॉर्डिंग आयोजित की जा सकती है।
Introduction
अन्य सूक्ष्मइमेजिंग विधियों 1,2,3,4,5,6,7,8 के विपरीत, विवो फाइबर-ऑप्टिक-आधारित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र में रक्त प्रवाह की गतिशीलता को मापने की अनुमति देता है, किसी भी गहराई पर, उच्च गति पर (फील्ड-ऑफ-व्यू आकार9 के आधार पर 240 हर्ट्ज तक)।). एक फाइबर-ऑप्टिक जांच 3 μm रिज़ॉल्यूशन पर विवो कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग इमेजिंग में सक्षम बनाती है क्योंकि जांच की नोक (5000-6000 3 μm व्यास व्यक्तिगत फाइबर के बंडल से बना एक लेंस-कम उद्देश्य) को रुचि के फ्लोरोसेंट लक्ष्य के 15 μm के भीतर माइक्रोइलेक्ट्रोड की सटीकता के साथ तैनात किया जा सकता है। विवो टू-फोटॉन इमेजिंग के साथ, फ्लोरोफोर को पहले इमेजिंग लक्ष्य में पेश किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, फ्लोरेसिन डेक्सट्रान (या क्वांटम डॉट्स) को वाहिका में इंजेक्ट किया जा सकता है, या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन को कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है, या ओरेगन ग्रीन बाप्टा -1 जैसे फ्लोरोसेंट रंगों को इमेजिंग से पहले कोशिकाओं में थोक-लोड किया जा सकता है।
इन तकनीकों का उपयोग करके हाल के शोध में पाया गया है कि म्यूरल सेल मोटर गतिविधि जो आईसीटील केशिका वासोस्पाज्म की ओर ले जाती है- अचानक कसना जो दौरेके दौरान भित्ति कोशिकाओं की स्थिति में होता है 9- आईसीटील हिप्पोकैम्पस9 में न्यूरोडीजेनेरेशन में योगदान कर सकता है। जबकि पिछले इमेजिंग अध्ययनों ने इन विट्रो और विवो पेरिसिलेट कसना में दवा अनुप्रयोगों 6,7,10,11,12 से जुड़े दिखाया, लील-कैम्पानारियो एट अल ने मुराइन मस्तिष्क में विवो सहज केशिका कसना का पहला सबूत पाया। मानव टेम्पोरल लोब मिर्गी के लिए प्रासंगिकता स्थापित करने के लिए, उन्होंने पुरुष (पी 30-40 पुराने) नॉकआउट (केओ) केवी 1.1 (केसीएनए 1-नल) चूहों 14,15 (जेएएक्स स्टॉक # 003532), मानव एपिसोडिक गतिभंग टाइप 115 का एक आनुवंशिक मॉडल का अध्ययन किया। पेरिसाइट्स ने सहज मिर्गी जानवरों और उनके जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) केकूड़े में पैथोलॉजिकल और शारीरिक हिप्पोकैम्पल भित्ति वाहिकासंकीर्णन दोनों को प्रेरित किया। इन अवलोकनों को डब्ल्यूटी जानवरों में दोहराया गया था, जिन्हें केनिक-एसिड के साथ मिर्गी प्रदान की गई थी, जिससे मिर्गी के अन्य रूपों के लिए उनके सामान्यीकरण का संकेत मिलता है। इसके अलावा, नए स्टीरियोलॉजिकल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण ों का उपयोग करते हुए, लील-कैम्पानारियो एट अल ने निर्धारित किया कि मिर्गी के जानवरों में एपोप्टोटिक-लेकिन स्वस्थ नहीं-न्यूरॉन्स स्थानिक रूप से हिप्पोकैम्पल माइक्रोवास्कुलचर के साथ युग्मित थे। क्योंकि एक्साइटोटॉक्सिसिटी का वाहिका से कोई ज्ञात स्थानिक संबंध नहीं है, इस परिणाम ने संकेत दिया कि असामान्य केशिका वासोस्पास्मिक इस्किमिया-प्रेरित हाइपोक्सिया मिर्गी में न्यूरोडीजेनेरेशन में योगदान देता है। चित्रा 1 सामान्य सेटअप का एक योजनाबद्ध दिखाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने जागृत चूहों में एक साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और फाइबर-ऑप्टिक पीसीईई प्रयोगों के लिए एक हेड-कैप संयम प्रणाली विकसित की, जिससे एनेस्थेटिक दवाओं के कारण संभावित प्रतिक्रिया संदूषण कम हो गया। हेड-क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को अमेरिकन एपिलेप्सी सोसाइटी से एक रिसर्च इनिशिएटिव अवार्ड द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और एरिज़ोना बायोमेडिकल रिसर्च कमीशन से एसएलएम को एक पुरस्कार दिया गया था, साथ ही साथ एसयूएनआई डाउनस्टेट हेल्थ साइंसेज यूनिवर्सिटी, न्यूयॉर्क स्टेट एम्पायर इनोवेशन प्रोग्राम में ओप्थाल्मोलॉजी विभाग को अंधापन इंक को रोकने के लिए अनुसंधान से एक चुनौती अनुदान भी दिया गया था। और नेशनल साइंस फाउंडेशन (0726113, 0852636, और 1523614), बैरो न्यूरोलॉजिकल फाउंडेशन, श्रीमती मैरियन रोशेल, श्रीमती ग्रेस वेल्टन और डिग्निटी हेल्थ सीड अवार्ड्स और नेशनल साइंस फाउंडेशन (0726113, 0852636, और 1523614) से संघीय अनुदान और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (पुरस्कार R01EY031971 और R01CA258021) से एसएलएम और एसएमसी को और अनुदान प्रदान करते हैं। इस काम को स्वास्थ्य मामलों के लिए सहायक रक्षा सचिव के कार्यालय द्वारा भी पुरस्कार संख्या 10के तहत समर्थन दिया गया था। W81XWH-15-1-0138, S.L.M. एल-सी को स्पेनिश शिक्षा मंत्रालय से जोस कैस्टिलेजो फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। हम ओ कैबलेरो और एम लेडो को उनकी तकनीकी सलाह और सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
Riferimenti
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