Доклиническая конфокальная лазерно-сканирующая эндомикроскопия (pCLE) капилляров гиппокампа у бодрствующих мышей in vivo
Summary
В то время как многофотонная визуализация эффективна только на ограниченных глубинах от поверхности ткани, с помощью pCLE можно получить изображение с разрешением 3 мкм на любой глубине. В данной работе мы представляем протокол проведения pCLE-визуализации для измерения микрососудистой динамики в гиппокампе иктальных и диких мышей.
Abstract
Целью этого протокола является описание доклинической конфокальной лазерной сканирующей эндомикроскопии (pCLE) с оптоволоконным пучком в ее специфическом применении для выяснения эффектов капиллярного кровотока во время судорог, вызванных клетками стенки. Визуализация коры головного мозга in vitro и in vivo показала, что сужение капилляров, вызванное перицитами, может быть результатом функциональной локальной нейронной активности, а также применения лекарств у здоровых животных. Здесь представлен протокол о том, как использовать pCLE для определения роли микроваскулярной динамики в дегенерации нервов при эпилепсии на любой тканевой глубине (в частности, в гиппокампе). Мы описываем технику удержания головы, которая была адаптирована для регистрации pCLE у бодрствующих животных, чтобы устранить потенциальные побочные эффекты анестетиков на нейронную активность. Используя эти методы, электрофизиологические и визуализирующие записи могут проводиться в течение нескольких часов в глубоких нейронных структурах головного мозга.
Introduction
В отличие от других методов микроскопической визуализации 1,2,3,4,5,6,7,8, волоконно-оптическая конфокальная микроскопия in vivo позволяет измерять динамику кровотока в любом участке мозга, на любой глубине, с высокой скоростью (до 240 Гц в зависимости от размера поля зрения9). Волоконно-оптический зонд позволяет получать изображения с конфокальным лазерным сканированием in vivo с разрешением 3 мкм, поскольку кончик зонда (объектив без линзы, состоящий из пучка отдельных волокон диаметром 5000-6000 диаметром 3 мкм) может быть позиционирован с точностью микроэлектрода в пределах 15 мкм от интересующей флуоресцентной мишени. Как и при двухфотонной визуализации in vivo, флуорофоры должны быть предварительно введены в объект визуализации. Например, флуоресцеин декстран (или квантовые точки) могут быть введены в сосудистую сеть, или генетически кодируемые флуоресцентные белки могут быть трансфицированы в клетки, или флуоресцентные красители, такие как Oregon Green BAPTA-1, могут быть загружены в клетки перед визуализацией.
Недавние исследования с использованием этих методов показали, что моторная активность клеток стенки, приводящая к спазмам иктальных капилляров — внезапным сужениям, возникающим в положении клеток стенки во время судорог 9, — может способствовать нейродегенерации в иктальном гиппокампе9. В то время как предыдущие исследования визуализации показали сужение перицитов in vitro и in vivo, связанное с применением лекарств 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. обнаружили первые доказательства спонтанных сужений капилляров in vivo в мозге мышей. Чтобы установить связь с височной эпилепсией человека, они изучили самцов (P30-40) нокаутированных (KO) Kv1.1 (kcna1-null) мышей 14,15 (JAX stock #003532), генетическую модель эпизодической атаксии человека типа 115. Перициты вызывали как патологические, так и физиологические вазоконстрикции гиппокампа9 у животных со спонтанной эпилепсией и их однопометников дикого типа (WT). Эти наблюдения были воспроизведены на животных WT, ставших эпилептиками с помощью каиновой кислоты, тем самым указывая на их генерализацию на другие формы эпилепсии. Кроме того, Leal-Campanario et al. определили, используя новые подходы стереологической микроскопии, что апоптотические, но не здоровые нейроны у животных, страдающих эпилепсией, пространственно связаны с микроциркуляторным руслом гиппокампа. Поскольку эксайтотоксичность не имеет известной пространственной связи с сосудистой системой, этот результат указывает на то, что аномальная капиллярная вазоспазмическая ишемия, индуцированная гипоксией, способствует нейродегенерации при эпилепсии. На рисунке 1 показана схема общей установки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали систему фиксации головы для одновременного проведения электрофизиологических и волоконно-оптических экспериментов pCLE на бодрствующих мышах, снижая потенциальную ответную контаминацию из-за анестезирующих препаратов. Головной колпачок и монтажное устройство просты ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект был профинансирован премией Research Initiative Award от Американского общества эпилепсии и премией от Комиссии по биомедицинским исследованиям штата Аризона для S.L.M., а также грантом от Research to Prevent Blindness Inc. для отделения офтальмологии в Университете медицинских наук штата Нью-Йорк Даунстейт, Инновационной программой Империи штата Нью-Йорк. и другие гранты от Национального научного фонда (0726113, 0852636 и 1523614), Неврологического фонда Барроу, г-жи Мэриан Рошель, г-жи Грейс Велтон и премии Dignity Health SEED, а также федеральные гранты от Национального научного фонда (0726113, 0852636 и 1523614) и Национального института здравоохранения (награды R01EY031971 И R01CA258021), для S.L.M и S.M.C. Эта работа также была поддержана Канцелярией помощника министра обороны по вопросам здравоохранения в рамках гранта No W81XWH-15-1-0138, в S.L.M. Л.-К. получил стипендию Хосе Кастильехо от Министерства образования Испании. Мы благодарим О. Кабальеро и М. Ледо за их технические консультации и помощь.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
Riferimenti
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscienze. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
