Questo metodo descrive il posizionamento degli innesti della vena di interposizione in conigli, la trasduzione degli innesti e il raggiungimento dell'espressione del transgene durevole. Questo permette l'indagine su ruoli fisiologici e patologici di transgeni e loro prodotti proteici nelle vene innestate e il test di terapie geniche per la malattia dell'innesto della vena.
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Articolo metodologico
Un modello del coniglio di espressione del Transgene durevole nella vena giugulare di innesti di interposizione dell'arteria carotica comune
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Chirurgia di bypass dell'innesto della vena è un trattamento per la malattia occlusiva arteriosa; Tuttavia, il successo a lungo termine è limitata dalla guasto dell'innesto a causa di trombosi, iperplasia intimale ed aterosclerosi. L'obiettivo di questo articolo è quello di illustrare un metodo per posizionare gli innesti bilaterali interposizione venosa in un coniglio, poi trasducendo gli innesti con un vettore di trasferimento del gene che raggiunge l'espressione del transgene durevole. Il metodo consente l'indagine dei ruoli biologici di geni e loro prodotti proteici nell'omeostasi dell'innesto della vena normale. Inoltre permette il testing di transgeni per le attività che potrebbero impedire il guasto dell'innesto di vena, ad es., se l'espressione di un transgene impedisce la crescita di neointimale, riduce l'infiammazione vascolare o riduce l'aterosclerosi in conigli alimentati con una dieta ad alta percentuale di grassi. Durante un intervento chirurgico di sopravvivenza iniziale, i segmenti di destra e di sinistra della vena giugulare esterna sono asportati e messi bilateralmente come invertita innesti di interposizione dell'arteria carotica comune di fine--lato. Durante un secondo intervento di sopravvivenza, effettuato 28 giorni più successivamente, ciascuno degli innesti è isolato dalla circolazione con clip vascolari e i lumen sono pieni (tramite un'arteriotomia) con una soluzione contenente un vettore (HDAd) adenovirale helper-dipendente. Dopo 20 min di incubazione, la soluzione di vettore è aspirata, arteriotomia viene riparato e flusso viene ripristinato. Le vene si raccolgono a intervalli di tempo dettate da singoli protocolli sperimentali. Il ritardo di 28 giorni tra il posizionamento dell'innesto e la trasduzione è necessario garantire l'adeguamento dell'innesto della vena per la circolazione arteriosa. Questo adattamento evita rapida perdita di espressione del transgene che si verifica negli innesti di vena trasformati prima o immediatamente dopo l'innesto. Il metodo è unico nella sua capacità di raggiungere l'espressione del transgene durevole, stabile nelle vene innestate. Rispetto ad altri modelli di innesto di grande vena animali, conigli hanno vantaggi di basso costo e facile movimentazione. Rispetto ai modelli dell'innesto della vena del roditore, conigli sono più grandi e più facile da manipolare vasi sanguigni che forniscono abbondante tessuto per l'analisi.
Introduzione
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica in cui accumulo di lipidi e di infiammazione nella parete del vaso sanguigno portano a restringimento del lume vascolare, attacchi cardiaci, ictus e perdita di arti1,2. Interventi percutanei (ad es., angioplastica e stenting) e terapia medica (ad es., agenti di statine e antipiastriniche) sono trattamenti utili per aterosclerosi; Tuttavia, essi sono spesso inefficaci nel trattamento della malattia ostruttiva severa sia nelle circolazioni coronariche e periferiche. L'innesto di esclusione, utilizzando segmenti di vena autogena, rimane una pr....
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Protocollo
Tutti i protocolli animale e gli studi sono stati approvati dall'Università di Washington Office of Animal Welfare.
1. pre-operazione (per tutti gli interventi chirurgici)
- Anestetizzare il coniglio con 30 mg/kg xylazina ketamina e 1,5 mg/kg per via intramuscolare (IM) nei muscoli paraspinali.
Nota: Cibo e acqua non sono limitate prima della chirurgia. - In attesa di sufficiente profondità dell'anestesia, è possibile impostare le tabelle in preparazione camera e sala operatoria (OR).
- Preparare la stanza di preparazione per la rasatura del collo del coniglio e il posizionamento della porta per via endovenosa (IV) ....
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Risultati
La competenza tecnica di un nuovo operatore deve essere convalidata prima che l'operatore può utilizzare questo metodo per generare dati sperimentali. La prima pietra miliare che deve realizzare un nuovo operatore è la pervietà dell'innesto della vena coerente dopo l'ambulatorio iniziale l'innesto della vena e la trasduzione in ritardo l'ambulatorio successivo. Oltre il 90% la pervietà dopo ciascuno degli ambulatori è auspicabile e realizzabile. L'evidenza può essere valutata in modo non .......
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Discussione
Punti critici in questo protocollo comprendono la gestione dell'anestesia, anticoagulazione manipolazione chirurgica della vena arteria/innestato e misure emodinamiche della vena innestata. Corretta gestione dell'anestesia è critico in questo modello di chirurgia multipla di sopravvivenza che include due operazioni relativamente lunghe (in genere 3-3.5 h per l'innesto bilaterale della vena e 1.5-2.5 h per trasduzione dell'innesto bilaterale). Abbiamo amministrato l'anestesia con una punta conica e con intubazione endotra.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa Monouso | |||
| 3mL con ago 24G | Becton Dickinson | 309571 | 2x per chirurgia di innesto venoso; 2x per chirurgia di trasferimento genico |
| 1 mL siringa con ago 27G | Becton Dickinson | 309623 | 2x per chirurgia di innesto venoso, 5x per chirurgia di trasferimento genico |
| Ago 19G | Becton Dickinson | 305187 | Gene siringa da |
| , luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| , 24Ga x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| ago 21G | Becton Dickinson | 305165 | Chirurgia di trasferimento genico e per siringa da 20 ml di |
| garza salina 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per intervento chirurgico |
| 3-0 sutura di seta | Covidien Ltd. | Sutura in seta S-244 | |
| 5-0 | Covidien Ltd. | Sutura in polipropilene S-182 | |
| 7-0 | CP Medical | 8703P | |
| Sutura in polipropilene 7-0 CP | Medical | 8648P | Chirurgia del trasferimento genico |
| Sutura all'acido poliglicolico 5-0 | CP Medical | 421A | |
| Sutura all'acido poliglicolico 3-0 | CP Medical | 398A | |
| Tamponi imbevuti di alcol | Covidien Ltd. | 6818 | Per il posizionamento della linea endovenosa |
| Tappo del catetere | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamina HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | ||
| Xilazina, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaina, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaina 0,5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beutanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | solo chirurgia del raccolto |
| Buprenorfina HCl, 0,3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV sacca, 0,9% cloruro di sodio | Baxter | 2B1309 | |
| eparina (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverina (3,5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluito da 30mg/mL di stock; Utilizzare 1 ml massimo |
| cerotto Fentanil, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurano | Fornitori multipli | Numero di catalogo non disponibile | |
| Vettore | Solo chirurgia di trasferimento genico | ||
| Strumenti chirurgici | |||
| Metzenbaum Porta aghi 7" dritto | Roboz | RS-7900 | |
| Forbici operatorie 6,5" dritto smussato/smussato | Roboz | RS-6828 | |
| Porta aghi /con forbici da sutura | Miltex | 8-14-IMC | |
| Forbici Castroviejo | Roboz | RS-5658 | |
| Porta aghi Castroviejo, 5,75" dritto con blocco | Roboz | RS-6412 | |
| Forbici Stevens 4,25" curvo smussato/smussato | Roboz | RS-5943 | |
| Divaricatore Alm 4" 4X4 5mm rebbi smussati | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Morsetto per asciugamani Backhaus 3,5" | Roboz | 4x | |
| Pinza per impostazione micro clip 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Clip micro vascolari, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm di lunghezza |
| Pinza Bonaccodato, 4" (10 cm) dentellature longitudinali lunghe, punta seghettata a croce, larghezza della punta 1,2 mm | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 pinze Inox misura della punta .17 & volte; .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe pinze, 4" (10 cm) lungo seghettato dritto, punta da 0,8 mm | Roboz | RS-5280 | |
| Pinze per zanzare Halstead, 5" dritte, punte da 1,3 mm | Roboz | RS-7110 | 2x |
| pinze per zanzare Halstead, 5" curve, punte da 1,3 mm | Roboz | RS-7111 | |
| Pinze per zanzare Jacobson 5" curve extra delicate, punte da 0,9 mm | Roboz | RS-7117 | |
| Pinza Kantrowitz, 7,25" delicata a 90 gradi, punte da 1,7 mm | Roboz | RS-7305 | |
| Pinza per tessuti 5", 1X2 denti, larghezza punta 2 mm | Roboz | RS-8162 | |
| Pinza Allis-Baby, 12 cm, 4x5 denti, larghezza punta 3 mm | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Pinza Adson, 12 cm, seghettata, diritta | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Manipolo ed elettrodo per elettrochirurgia veterinaria | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Coperta e pompa per acqua calda circolante | Fornitori multipli | Numero di catalogo non disponibile | |
| Unità di riscaldamento Bair hugger | 3M | Modello 505 | |
| Pompa per infusione IV | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Vaporizzatore e scavenger di isoflurano | Numero di catalogo non disponibile | ||
| Monitor multiparametrico veterinario | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Unità di elettrochirurgia veterinaria | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Microscopio operatorio | D.F. Vasconcellos | M900 | Ingrandimento 25X per la chirurgia dell'innesto venoso; ingrandimento 16X per la chirurgia del trasferimento genico |
Riferimenti
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and ris....
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Ristampe e permessi
