Summary
Aquí se muestra un método para la preparación de la matriz extracelular de la lengua (TEM) con descelularización eficiente. La temperatura puede utilizarse como andamios funcionales para la reconstrucción de un modelo de carcinoma de células escamosas (TSCC) lengua bajo condiciones de cultivo estático o agitada.
Abstract
Con el fin de construir un modelo eficaz y realista para lengua squamous cell carcinoma (TSCC) en vitro, los métodos fueron creados para producir decellularized lengua matriz extracelular (TEM) que proporciona funciones andamios para la construcción de TSCC. TEM proporciona un nicho en vitro para el crecimiento celular, diferenciación y migración celular. Las microestructuras de nativo matriz extracelular (ECM) y composiciones bioquímicas retenidos en la matriz de decellularized proporcionan nichos de tejidos específicos para el anclaje de las células. La fabricación de TEM puede ser realizada por digestión de desoxirribonucleasa (DNasa) acompañada de una seria de tratamiento orgánico o inorgánico. Este protocolo es fácil de operar y asegura alta eficiencia para la descelularización. El TEM demostró cytocompatibility favorable para las células TSCC bajo condiciones de cultivo estático o agitada, que permite la construcción del modelo TSCC. Un biorreactor hecho a sí mismo también fue utilizado para la persistente condición agitada para el cultivo celular. TSCC reconstruido usando TEM demostraron las características y propiedades que se asemejan a la histopatología clínica de TSCC, sugiriendo el potencial en investigación TSCC.
Introduction
La lengua tiene varias funciones importantes, tales como deglución, articulación y degustación. Así, el deterioro de la función de la lengua tiene gran impacto en la calidad de vida de pacientes1. La neoplasia más frecuente en la cavidad bucal es lengüeta carcinoma de célula squamous (TSCC), que generalmente ocurre en personas que beben alcohol o fuman tabaco2.
En los últimos años, se ha logrado poco progreso en la investigación fundamental de TSCC. La falta de investigación eficiente en vitro modelos restos para ser uno de los mayores problemas. Por lo tanto, la matriz extracelular (ECM) resulta para ser una solución potencial. Desde ECM es una estructura de red compleja compuesta por componentes de la matriz altamente organizados, materiales del andamio con un ECM-como la estructura y composición sería competentes para la investigación del cáncer. ECM decellularized perfectamente puede proporcionar el nicho de las células desde el mismo origen en vitro, que resulta para ser la más importante ventaja de ECM.
ECM puede conservarse con componentes celulares de los tejidos a través de la descelularización mediante detergentes y enzimas. Varios componentes de la ECM, incluyendo colágeno, fibronectina y laminina en la matriz de decellularized proporcionan un microambiente natural-tejido-como de células cultivadas, promover la supervivencia, proliferación y diferenciación de las células3. Además, la inmunogenicidad para el trasplante se puede reducir a un mínimo con la ausencia de componentes celulares en ECM.
Hasta ahora, métodos de fabricación para ECM decellularized se han ensayado en diferentes tejidos y órganos, como corazón4,5,6,7, hígado8,9,10 ,11, pulmón12,13,14,15,16,17y18,de riñón19 , 20. sin embargo, se ha encontrado ninguna investigación relevante en trabajos similares en la lengua al mejor de nuestro conocimiento.
En este estudio, matriz extracelular de la lengua decellularized (TEM) se fabricó eficientemente y barato por una serie de tratamiento físico, químico y enzimático. Entonces la temperatura solía recapitular TSCC en vitro, mostrando una simulación adecuada para el desarrollo y comportamiento TSCC. TEM tiene buena biocompatibilidad, así como la capacidad de guiar a las células hacia el nicho de tejidos específicos, que indica que TEM puede tener gran potencial en TSCC investigación3. El protocolo que se muestra a continuación proporciona una opción para investigadores estudiando en patogenesia o terapias clínicas de TSCC.
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Protocol
Animal todo el trabajo fue realizado de acuerdo con la ley de bienestar animal, las pautas y aprobado por institucional Animal cuidado y uso, Universidad de Yat-sensor del sol.
1. preparación de TEM
- Ejecutar ratones por dislocación cervical y retire las lenguas utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas estériles.
- Sumerja las lenguas en etanol al 75% durante 3 minutos, luego poner cada lengua en 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) con 1 mL de fosfato estéril de 10 mM de solución amortiguadora (SSAF).
Nota: La concentración de PBS en los siguientes pasos es igual a la concentración en este paso. - Lisis de la célula por hielo-deshielo: congelar las lenguas en tubos de EP a-80 ° C durante 1 h y luego descongelar las lenguas a temperatura ambiente durante 45 minutos por 3 ciclos.
- Carga de cada lengua sobre un pedazo de sutura quirúrgica, utilizando una aguja quirúrgica y envuelva el extremo de la sutura con un pequeño trozo de papel de aluminio estéril. Realizar la operación en un plato de cultura 3,5 cm o 6 cm que contiene 75% de etanol en condiciones estériles.
Nota: La longitud adecuada de cada pieza de sutura quirúrgica es de unos 20 cm y el tamaño adecuado de cada pieza de papel de estaño es de 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). La lengua debe colocarse cerca del papel de estaño. - Enjuague cada lengua con 3 mL de PBS estéril en una placa de cultivo 3,5 cm o 6 cm para 30 s. realizar esta operación en condiciones estériles.
- Lavar la lengua con agua ultrapura: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de agua ultrapura estéril a una concentración final de 90 μg/mL. Poner las lengüetas al frasco que contiene una barra de agitación. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
Nota: Hasta 5 lenguas se pueden poner en la misma botella en la consideración de hermanamiento de la sutura. El estaño está en el extremo de la sutura en la botella para evitar que la lengua caiga. Las lenguas se deben colocar 2 cm de altura desde el fondo de la botella mediante el ajuste de la longitud de la sutura queda dentro de la botella. Esta nota está también para pasos 1.8, 1.10, 1.12 y 1.16. - Puso la botella en un agitador magnético durante 12 h.
- Lavar la lengua con NaCl: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de estéril 1 M de NaCl a una concentración final de 90 μg/mL. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
- Puso la botella en un agitador magnético durante 24 h.
- Célula de la lisis por Triton X-100: Añadir ampicilin a una concentración final de 90 μg/mL en una botella de boca ancha 250 ml estéril 2% Tritón X-100 en PBS. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
- Puso la botella en un agitador magnético durante 48 h.
- Lavar la lengua con CaCl2/MgCl2: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de estéril 5 mM CaCl2/MgCl2 a una concentración final de 90 μg/mL. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
- Puso la botella en un agitador magnético durante 24 h.
- Digestión de la ADNsa: Añadir 1 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) a cada tubo de EP. Agregar ADNasa en HBSS respectivamente a una concentración final de 300 μm. Mueva cada lengua en cada tubo de EP, con parte de la sutura del tubo exterior. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
Nota: Asegúrese de que la parte de la sutura que permanece dentro de las botellas en los pasos anteriores también permanece dentro del tubo de la EP en este paso y asegúrese de que la parte de la sutura que queda fuera de las botellas en los pasos anteriores sigue siendo también tubo exterior de la EP en este paso. - Incubar las lenguas en el EP de los tubos a 37 ° C durante 24 h.
- Lavar la lengua con PBS: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de PBS estéril a una concentración final de 90 μg/mL. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
- Puso la botella en un agitador magnético durante 24 h.
- Guarde el TEM preparado en PBS estéril a 4 º C hasta su uso.
2. tres dimensiones (3D) reconstitución de TSCC
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Modelismo estático de TSCC
- Semillas 1.0 x 106 TSCC células (Cal27) en una placa de cultivo de 3,5 cm. Añadir 3 mL de Dulbecco modificado Eagle medio/F12 (DF12) con 10% suero bovino fetal (FBS), ampicilin 90 μg/mL y 90 kanamicina μg/mL.
- La cultura las células Cal27 a 37 ° C durante 2 a 3 días. Asegúrese de que las células cubren al menos el 60% área de la parte inferior del plato.
- Cargar TEM en la monocapa Cal27 en la placa de cultivo.
- Poner el plato en un incubador de CO2 a 37 ° C durante 28 días.
- Actualizar el medio de cultivo cada día durante el proceso de cultivo celular. La concentración de CO2 en la incubadora es 5%.
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Construcción de modelo TSCC agitada
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Preparación de un minibioreactor revuelto hecho a sí mismo
- Saque el émbolo de una jeringa de 10 mL.
- Cavar un agujero (diámetro de 1 cm) cerca de la terminal inferior de la barra y carga una barra de agitación en el agujero.
- Cavar un agujero (diámetro de 0,5 cm) en el centro de la tapa de una botella de plástico boca ancha y poner la barra de pistón a través de la tapa.
- Cortar la mitad de un tubo de centrífuga de 50 mL y soldar en el lado exterior de la tapa de la botella.
- Colocar anzuelos a la barra envolviendo la varilla con líneas de pesca que se ataban a los anzuelos.
Nota: Hasta 4 anzuelos pueden sujetarse a una varilla. - Autoclave el complejo hecho a sí mismo antes de su uso.
Nota: No autoclave la botella plástica de boca ancha. Utilice una nueva botella de plástico estéril de boca ancha mientras que las células de cultivo.
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Preparación de un minibioreactor revuelto hecho a sí mismo
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Cultura de célula dinámica
- Semillas 1.0 x 106 Cal27 células individuales en el self-made minibioreactor. Añadir 150 mL de medio de DF12 que contiene 10% FBS, 90 ampicilin μg/mL y 90 μg/mL de kanamicina.
- Cargar TEM en la minibioreactor utilizando anzuelos atados a la barra.
- Apriete el tapón de la botella y poner la minibioreactor en un agitador magnético. Activar minibioreactor a 200 rpm en un incubador de CO2 a 37 ° C durante 7 a 14 días.
Nota: La concentración de CO2 en la incubadora de CO2 es 5%.
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Representative Results
Este protocolo para la preparación de TEM resulta para ser eficiente y apropiado. El TEM demostró descelularización perfecto en comparación con los tejidos de la lengua materna. La eficacia de la descelularización fue confirmada por hematoxilina-eosina (HE) tinción (figura 1A-B). LO resultados de tinción desaparición completa reveladora de tinción nuclear en TEM (figura 1B). Por otra parte, la cuantificación de contenido de ADN de trabajo previo demostró que ADN fue quitado casi totalmente de TEM3. Este protocolo también mostraron raros daños a la integridad de tejido al eliminar componentes de la célula (figura 1B).
Reconstrucción 3D de TSCC mediante TEM y un minibioreactor hecho a sí mismo (figura 2A-B) logró resultados satisfactorios. La coloración mostró que las células Cal27 en la TEM presentaban características patológicas típicas de TSCC (figura 2C-d). Las células en condiciones de cultivo agitado presentan migración unicelular (figura 2C) o colectivo (figura 2D) en áreas diferentes de la lesión. En condiciones de cultivo estático, Cal27 células también forman estructuras invasoras en el TEM, pero tardó un tiempo más largo (figura 2E). Además, una línea de células de osteosarcoma humano U2OS también fue introducida en el mismo sistema de cultivo agitado. Aunque las células U2OS podrían vivir en el medio de cultivo, no se encontraron en el TEM (figura 2F). El TEM demostró biocompatibilidad diferentes para diferentes tipos de células cancerosas, lo que sugiere que las células tumorales diferentes pueden necesitar diferentes microambientes que florezca.
Figura 1 : Preparación de TEM. (A) lo de las lenguas maternas de los ratones. Barra de escala = 100 μm. (B) de decellularized TEM de los ratones. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Reconstitución de TSCC por TEM. (A) la descripción de un minibioreactor hecho a sí mismo. (B) la vista de la posición de la TEM-carga de un minibioreactor hecho a sí mismo. (C) HE coloración de agitada TSCC cultivado 14 días con TEM. Fenómenos de invasión de células individuales se indican mediante flechas negras. Barra de escala = 50 μm. (D) él de agitada TSCC cultivado 14 días con TEM. Fenómenos de invasión colectiva se indican mediante flechas negras. Barra de escala = 50 μm. (E) la coloración de la estática de 28 días cultivadas TSCC con TEM. Fenómenos de invasión de células individuales se indican mediante flechas negras. Barra de escala = 100 μm. (F) de 14 días agitados U2OS las células cultivadas con TEM. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un protocolo bien establecido para la fabricación de ECM decellularized debe conservar la composición nativa de ECM al eliminar componentes celulares en los tejidos casi totalmente21. A pesar de los protocolos actualmente divulgado de la descelularización que requieren de la perfusión a través de la vasculatura para quitar materiales celulares por transporte convectivo, agitación mecánica fue adoptada aquí, conocido como un método sencillo y barato tradicional22 , 23 , 24 , 25 , 26. por otra parte, puesto que la lengua es rica en lingualis y tiene pocos vasos vasculares voluminosos, este protocolo es más conveniente para los tejidos de la lengua que otros protocolos descritos anteriormente.
Además, este protocolo para la producción de TEM lleva a cabo un apropiado descelularización de resistencia moderada, evitando la destrucción o disolución de la membrana base que puede ser causada por descelularización de alta resistencia tales como sodio dodecil sulfato) SDS) tratamiento3. Además, el protocolo también trabajó efectivamente en la lengua de rata y cerdo (datos no mostrados), lo que sugiere que el método podría utilizarse comúnmente sobre lenguas de varias especies3.
Cabe destacar que hay algunos pasos críticos o detalles en este protocolo, que podría influir directamente en los resultados. Un paso importante es la digestión de las células de la lengua por la ADNasa. Si el tiempo de digestión no es suficiente o la ADNasa no funciona eficientemente, apenas se lograría la descelularización de la lengua. Otra cosa que debe notarse es que la velocidad de rotación para el biorreactor no debería ser demasiado rápida, teniendo en cuenta el daño a TEM. Por otra parte, un ambiente estéril para esta operación es muy importante en el protocolo.
A pesar de las estrictas reglas arriba, el protocolo para la preparación de TEM se puede ajustar en cierta medida. Lavar la lengua con agua ultrapura o PBS para unas horas más que el tiempo que el protocolo sugiere obviamente no afectaría a la fabricación de TEM. Sin embargo, puesto que el protocolo necesita casi una semana para preparar el TEM, no puede satisfacer las demandas inmediatas de TEM.
El TEM muestra gran valor en la construcción del modelo TSCC. Junto con un minibioreactor hecho a sí mismo, pueden conectar suspendido Cal27 células en estructura infiltrante similar TEM y la forma que se asemejan a humanos TSCC histopatología3. Esto podría ser un modelo ideal para vigilar e investigar la invasión y metástasis de TSCC in vitro. El modelo también podría beneficiarse del trabajo en las pruebas de drogas en TSCC. Teniendo en cuenta todo esto, el protocolo que presentamos puede tener gran potencial en la investigación TSCC.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo de becas de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31371390), el programa del proyecto de desarrollo estatal de alta tecnología (2014AA020702) y el programa de Guangdong ciencia y tecnología (2016B030231001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
