Fabrikation af tungen ekstracellulære Matrix og rekonstituering af tungen planocellulært karcinom In Vitro
Summary
En metode er vist her til forberedelse af tungen ekstracellulære matrix (TEM) med effektiv decellularization. TEM kan bruges som funktionelle stilladser til genopbygningen af et tungen planocellulært karcinom (TSCC) model statisk eller omrørt kultur betingelser.
Abstract
For at konstruere en effektiv og realistisk model for tunge planocellulært karcinom (TSCC) in vitro-blev metoder skabt til at producere decellularized tungen ekstracellulære matrix (TEM) der giver funktionelle stilladser for TSCC byggeri. TEM giver en in vitro- niche for cellevækst, differentiering og celle migration. Mikrostrukturer indfødte ekstracellulære matrix (ECM) og biokemiske kompositioner bevaret i matrixen decellularized indeholder væv-specifikke nicher for forankring celler. Fabrikation af TEM kan realiseres af deoxyribonuclease (DNase) fordøjelsen ledsaget med en alvorlig af organiske eller uorganiske forbehandling. Denne protokol er nem at betjene og sikrer høj effektivitet for decellularization. TEM viste positiv cytocompatibility for TSCC celler under statisk eller omrørt dyrkningsbetingelser, som giver mulighed for opførelse af TSCC model. En self-made bioreaktor blev også brugt til den vedvarende stirred betingelse for cellekultur. Rekonstrueret TSCC bruge TEM viste egenskaber der minder om kliniske TSCC histopatologi, tyder på potentialet i TSCC forskning.
Introduction
Tungen har forskellige vigtige funktioner, såsom deglutition, artikulation og smagning. Således har værdiforringelse af tungen funktion stor indvirkning på patienternes livskvalitet1. Den mest almindelige malignitet i mundhulen er tungen pladecellekræft (TSCC), som normalt forekommer i mennesker, der drikker alkohol eller ryge tobak2.
I de seneste år er der sket små fremskridt i grundforskning på TSCC. Manglen på effektive in vitro- forskning modeller er fortsat at være en af de største problemer. Således, den ekstracellulære matrix (ECM) viser sig for at være en mulig løsning. Eftersom ECM er et komplekst netværk ramme sammensat af velorganiseret matrix komponenter, være stillads materialer med en ECM-lignende struktur og sammensætning kompetente til kræftforskning. Decellularized ECM kan perfekt niche celler fra samme oprindelse i vitro, som viser sig for at være den mest markante fordel af ECM.
ECM kan opbevares med cellulære komponenter fjernes fra væv gennem decellularization ved hjælp af vaske-og rengøringsmidler og enzymer. Forskellige ECM komponenter, herunder kollagen, fibronektin, og laminin i decellularized matrix giver en indfødt-væv-lignende mikromiljø for dyrkede celler, fremmer overlevelse, spredning og differentiering af celler3. Derudover kan immunogenicitet til transplantation blive reduceret til et minimalt niveau med manglen på cellulære komponenter i ECM.
Hidtil, har fabrikation metoder for decellularized ECM været prøvet i forskellige væv og organer, såsom hjerte4,5,6,7, leveren8,9,10 ,11, lunge12,13,14,15,16,17, og nyre18,19 , 20. imidlertid ingen relevant forskning konstateret på lignende arbejde i tungen til bedste af vores viden.
I denne undersøgelse, blev decellularized tunge ekstracellulære matrix (TEM) fremstillet både effektivt og billigt af en række fysiske, kemiske og enzymatisk behandling. Derefter blev TEM brugt til at sammenfatte TSCC i vitro, viser en passende simulation for TSCC adfærd og udvikling. TEM har god biokompatibilitet samt evnen til at guide cellerne til væv-specifik niche, som angiver, at TEM kan have stort potentiale i TSCC forskning3. Den protokol, der er vist her giver et valg for forskere studerer på enten patogenese eller kliniske behandlinger af TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
En veletableret protokol for decellularized ECM fabrikation bør bevare de indfødte ECM sammensætning mens fjernelse af cellulære komponenter i væv næsten helt21. Trods i øjeblikket rapporteret decellularization protokoller, som kræver perfusion gennem Vaskulaturen fjerne materialer ved Konvektiv transport, blev mekanisk agitation vedtaget her, kendt som en traditionel enkel og billig metode22 , 23 , 24<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtten fra forskningstilskud fra National Natural Science Foundation of China (31371390), programmet for staten High-Tech Development Project (2014AA020702) og programmet for Guangdong videnskab og teknologi (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
Riferimenti
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
