In dieser Studie beschreiben wir eine in Ovo -System als ein viel versprechendes Instrument, Insulin-mimetischen Verbindungen in einem lebenden Organismus zu testen. Die Hauptvorteile sind angemessene Durchsatzraten und vertretbaren Kosten, die die Identifizierung von sekundären Pflanzenstoffen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften ermöglichen.
Erhöhte Blutzuckerwerte bei Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM), eine komplexe und multifaktorielle Stoffwechselerkrankung werden durch Insulin-Resistenz und β-Zellen Ausfall verursacht. Verschiedene Strategien, einschließlich die Injektion von Insulin oder die Verwendung von Insulin-sensibilisierende Medikamente wurden fortgesetzt, um T2DM zu behandeln oder zumindest die Symptome zu reduzieren. Darüber hinaus hat die Anwendung von pflanzlichen Verbindungen immer mehr Aufmerksamkeit erregt. Daher ist es notwendig, effiziente Testsysteme zu identifizieren und zu charakterisieren, Insulin-mimetischen Verbindungen zu finden. Hier haben wir eine modifizierte Küken Embryos Modell, das ermöglicht das Testen der synthetischen Verbindungen und Kräuterextrakte mit Insulin-mimetischen Eigenschaften entwickelt. Mit einer Fluoreszenz Mikroskopie-basierten primären Bildschirm, der die Translokation von glukosetransporters 4 (Glut4) an der Plasmamembran quantifiziert, konnten wir Verbindungen, vor allem pflanzliche Extrakte zu identifizieren, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Glukose führen Konzentrationen in Adipozyten. Die Wirksamkeit dieser Substanzen erfordert jedoch weitere Überprüfung in einem lebenden Organismus. So haben wir in Ovo Ansatz, um deren Blut Glukose-reduzierenden Eigenschaften zu identifizieren. Die Zulassung durch eine Ethik-Kommission ist nicht erforderlich, da die Verwendung von Hühnerembryos während der ersten zwei Drittel der Embryonalentwicklung keinen Tierversuch angesehen wird. Hier wird die Anwendung dieses Modells im Detail beschrieben.
Diabetes Mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Hyperglykämie gekennzeichnet und wird durch defekte Insulinsekretion oder Insulin Aktion1verursacht. Neunzig Prozent aller Diabetesfälle sind Kategorie Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), wo Einzelpersonen zu demonstrieren, Insulin-Resistenz und vor allem Insulin-Mangel2. Mehrere Faktoren sind dafür bekannt, die globale Inzidenz von T2DM, einschließlich Veränderungen im Lebensstil, insbesondere die Überernährung, Altern und Bewegungsmangel erhöhen. Rund 400 Millionen Menschen haben Diabetes Mellitus nach der International Diabetes Federation (IDF) weltweit. Diese Zahl wird voraussichtlich 600 Millionen innerhalb der nächsten 20 Jahre3zu erreichen.
Diabetische Komplikationen verursacht durch Hyperglykämie und Insulinresistenz, wie Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen, Glukoseintoleranz, koronare Herzkrankheit und zerebralen Gefäßerkrankungen, führen zu einer deutlich reduzierten Lebenserwartung und Qualität4. Betroffenen Personen erfordern Glukose-senkenden Pharmakotherapie; Allerdings ist die Verwendung von Drogen wie Metformin5 oft verbunden mit dramatischen Nebenwirkungen6,7,8. Daher sind weitere Antidiabetika Ansätze, die sicher, weithin verfügbar und kostengünstig sind erforderlich.
Verschiedene pflanzliche Verbindungen, Extrakte, Pflanzen und Nutraceuticals sind Feature-Insulin-mimetischen Eigenschaften zugeschrieben worden, durch die Modulation verschiedene Zellfunktionen. Ein wichtiges Merkmal ist die Stimulation der die Translokation von glukosetransporters 4 (GLUT4) an der Plasmamembran von intrazellulären Staufächer, wodurch eine erhöhte Aufnahme von Glucose in Muskel und Fettgewebe in Abwesenheit von Insulin, bekannt als Insulin-mimetischen Eigenschaften9. Zuvor haben wir einen Fluoreszenz-Mikroskopie-basierter Ansatz zur Quantifizierung des Translokation Prozess von GLUT410implementiert. Analyse der zahlreichen Pflanzenextrakte aus Extrakt Bibliothek11 mit dieser Assay führte bei der Identifizierung von vielversprechenden Kandidaten. Weitere Tests in lebenden Organismen sind jedoch erforderlich. In diesem Papier, eine modifizierte Küken Embryos Modell ausführlich beschriebene Ansatz erweist sich ein zukunftsträchtiges Modell zur Identifizierung von Substanzen mit Insulin-mimetischen Eigenschaften. Es stellt ein attraktives Instrument, die große Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Studien und bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu bestehenden Systemen wie akzeptablen Kosten, einfache Handhabung und angemessene Durchsatzraten. Darüber hinaus ist die Berechtigung von einer Ethikkommission nicht erforderlich.
Der HET-CAM-Assay ist eine weit verbreitete alternative Testsystem zu Tierversuchen in der Industrie-12. Das hier beschriebene in Ovo -System stellt eine modifizierte Version des HET-CAM-Assays. Während in seiner ursprünglichen Form HET-CAM Experimente werden durchgeführt, um die irritierenden Eigenschaften von Verbindungen und Formulierung oder die Analyse der Angiogenese14,15,16studieren, haben wir das Konzept zu testen angepasst Verbindungen mit vermeintlichen Insulin-mimetischen Eigenschaften12. Laut der Richtlinie 2010/63/EU benötigen Experimente mit nicht geschlüpft Vogelgrippe Embryonen während der ersten zwei Drittel der embryonalen Entwicklung keine Erlaubnis von einer Ethikkommission, da diese Experimente nicht Tierversuche gelten. Jüngste Studien haben bewiesen, die Eignung des in Ovo Systems, um die Wirksamkeit von ausgewählten Kräuter-Extrakten, charakterisieren die in einer GLUT4-Translokation-basierten primären Bildschirm10, Senkung des Blutzuckerspiegels in identifiziert wurden die das Fehlen von Insulin12,13. Kritische Punkte für eine gute Leistung des Systems in Ovo gehören: Erstens eine zuverlässige Züchter liefern die befruchteten Eizellen. Die klassische braune Hühner Lohmann ist eine gute Wahl der Rasse. Zweitens prüft die Umsetzung der Toxizität auszuschließende toxische Wirkungen der untersuchten Verbindung muss getan werden. Darüber hinaus ist die Vorbereitung eines geeigneten Blutgefäßes zur Blutentnahme wichtig. Es ist wichtig, das Schneiden von großen Schiffen in der chorioallantoic Membrane selbst, zu vermeiden, da dies zu einer nicht vorzuziehen Blutverlust führen kann. Darüber hinaus, bevor das Schiff auf den pH-Streifen geschnitten wird, hat es gestreichelt zu werden trocken mit Filterpapier um Verdünnung der das gesammelte Blut zu verhindern. Schließlich scheint eine ausreichende Anzahl von Experimenten wichtig zu sein. Es wird empfohlen, mit mindestens 10 Eizellen für jeden Zeitpunkt und eine dreifache Wiederholung des jeweiligen Experiments.
Natürlich gibt es einige Einschränkungen dieses Ansatzes in Ovo . Da es bis zu 30 Minuten dauert, bis die Stoffe durch die Eierschale Membran absorbiert und in engem Kontakt mit der chorioallantoic Membrane kommen, ist es nicht möglich, eine schnelle Reaktion des Embryos bei der angewandten Verbindung zu quantifizieren. Darüber hinaus können einige Verbindungen in die angewandte Konzentration giftig sein führt häufig zu Verletzungen der Blutgefäße in der chorioallantoic Membrane. Zytotoxizität Tests basierend auf langfristige Inkubation der Verbindungen für ca. 24 Stunden erscheint daher angemessen. Schließlich fanden wir, dass das Puffersystem für die Anwendung der Verbindungen eine erhebliche Auswirkungen auf die Leistung des Tests hat. 12 derzeit HBSS Puffer verwendet, da es in der kleinsten Wirkung auf den Blutzuckerspiegel des Embryos führt.
Für zukünftige Anwendungen möglicherweise zusätzlichen Puffersysteme als Alternative zu HBSS getestet werden. Darüber hinaus könnte der Einfluss von pflanzlichen Extrakten auf zusätzliche Blutwerte wie Cholesterin, Triglyceride oder Lipoproteine eine attraktive Frage sein.
Unser neues in-Ovo -System ist ein vielversprechender und wichtige Werkzeug, Stoffe mit Insulin-mimetischen Eigenschaften in einem lebenden Organismus ohne die Notwendigkeit einen Tierversuch zu testen. Daher, es füllt die Lücke zwischen in-vitro- und in-Vivo -Ansätzen. Im Vergleich zu bestehenden in Ovo Modell Systeme17 entfällt induzieren Diabetes durch die Streptozocin (STZ) Behandlung, wie wir Embryonen am Tag 10 oder 11 der Inkubation zu verwenden. In diesem Stadium Insulin-Produktion hat noch nicht begonnen, aber die Embryonen sind bereits Insulin empfindlich. Darüber hinaus kann Erlaubnis von einer Ethikkommission erforderlich sein, wenn Embryonen im Alter von 14-17 Tagen verwendeten17sind. Darüber hinaus ist im Vergleich zu alternativen Strategien18, die zusammengesetzte Anwendung wie hier beschrieben weniger schädlich und mühsam, Erhöhung experimentelle Durchsatz.
Zusammen genommen, diese in Ovo ist Ansatz ein attraktives System, wenn eine Blut-abnehmender Wirkung einer Insulin-mimetische Substanz muss in einem lebenden Organismus getestet werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Österreichischen Forschungsförderungsgesellschaft (FFG, Projektnummer 850681), der Hochschule für angewandte Wissenschaften Upper Austria grundlegende Finanzierung-Initiative (Projekt GlucoSTAR) und das Zentrum für technologische Innovation in der Medizin (Training Center) finanziert. Grundfinanzierung durch das Land Oberösterreich erhält.
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
Extracts | PEKISH extract library | ||
Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |