En enkel metod för isolering av sojabönor Protoplasts och ansökan till övergående gen uttryck analyser
Summary
Vi utvecklade ett enkelt och effektivt protokoll för beredning av stora mängder sojabönor protoplasts att studera komplexa regelverk och signalering mekanismer i levande celler.
Abstract
Sojabönor (Glycine max (L.) Merr.) är en viktig gröda art och har blivit en baljväxt modell för studier av genetiska och biokemiska vägar. Det är därför viktigt att etablera en effektiv övergående gen uttryck system i sojabönor. Här rapporterar vi ett enkelt protokoll för beredning av sojabönor protoplasts och dess tillämpning för övergående funktionella analyser. Vi hittade att unga unifoliate blad från sojabönor plantor resulterade i stora mängder av hög kvalitet protoplasts. Genom att optimera en PEG-kalcium-medierad omvandling metod, uppnått vi hög förvandling effektivitet använder sojabönor unifoliate protoplasts. Detta system ger en effektiv och mångsidig modell för granskning av komplexa regelverk och signalering mekanismer i levande sojabönor celler och får hjälp att bättre förstå olika cellulär-, utvecklings- och fysiologiska processer av baljväxter.
Introduction
Protoplasts är växtceller som har cellväggar bort. De behålla de flesta av funktioner och aktiviteter av växtceller, protoplasts är en bra modell för att observera och utvärdera olika cellulära händelser och är värdefulla verktyg att studera somatisk hybridisering1 och växt regenerering2. Protoplasts har utnyttjats också allmänt för växt förvandling3,4,5, eftersom cellväggarna annars skulle blockera passagen av DNA i cellen. Protoplasts besitter några av fysiologiska svaren och cellulära processer av intakt växter, därför erbjuder grundläggande värde i grundforskning att studera subcellulär protein lokalisering6,7,8, protein-protein interaktioner9,10, och arrangören aktivitet11,12,13 i levande celler.
Isolering av växten protoplasts rapporterades först i 196014 och protokollen för både isolering och omvandling av protoplasts har utvecklats och optimerats. Ett standardförfarande av protoplast isolering innebär att skära av bladen och enzymatisk nedbrytning av cellväggar, följt av separation av släppt protoplasts från icke-smält vävnad skräp. Omvandling strategier inkluderar elektroporation15,16, Mikroskop17,18och polyetylenglykol (PEG)4,5,19 metoder. Ett stort antal arter har rapporterats framgångsrik för protoplast isolering, inklusive Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 och andra prydnadsväxter familjer23,24. Medan olika vävnadstyper används i olika arter, har ett system av övergående uttryck i Arabidopsis mesophyll protoplast (TEAMP) isolerade från bladen på modell växten Arabidopsis thaliana varit väl etablerade25 och allmänt antagna till applikationsmöjligheter.
Sojabönor (Glycine max (L.) Merr.) är en av de viktigaste proteinet och olja grödor26. Till skillnad från Arabidopsis och ris, är att erhålla genmodifierade sojabönor växter kända för att vara ganska svårt och låga effektivitet. Agrobacterium tumefaciens-medierad infiltration har varit populärt används för övergående gen uttryck studier i de epidermala cellerna i tobak27 och plantor i Arabidopsis28,29, medan Agrobacterium rhizogenes har använts för omvandling av håriga rötter i sojabönor30. Virus-inducerade genen ljuddämpningssystemet metoder använts för nedreglering av mål gener31,32 och övergående uttryck33 i en systemisk sätt. Protoplasts ger en värdefull och mångsidigt alternativ till dessa synsätt. Protoplasts kan erhållas från sojabönors aboveground material och tillåter snabb och synkroniserade transgenens uttryck. Sedan första framgångsrika isolering av sojabönor protoplasts i den 198334, har det dock begränsat rapporter om tillämpningen av protoplasts i sojabönor35,36,37, 38, främst på grund av relativt låg avkastning av sojabönor protoplasts.
Här beskriver vi ett enkelt och effektivt protokoll för isolering av sojabönor protoplasts och dess tillämpning för övergående gen uttryck studier. Använder unga unifoliate blad från sojabönor plantor, kunde vi få stora mängder viktig protoplasts inom några timmar. Dessutom har vi optimerat en PEG-kalcium-medierad omvandling metod som är enkel och låg kostnad att leverera DNA in sojabönor protoplasts med hög verkningsgrad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll för isolering av sojabönor protoplasts och ansökan till övergående uttryck studier har testats grundligt och fungerar mycket bra i vårt laboratorium. Förfaranden som är enkla och lätta och kräver vanlig utrustning och minsta möjliga kostnad. Våra protokoll ger stora mängder enhetlig, hög kvalitet protoplasts jämfört med tidigare rapporterade metoder34,35,36,37<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av programmet växt Genome Research från National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
Riferimenti
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -. J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -. Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
