Invasiva hemodynamiska karakterisering av Portal-hypertensiv syndrom hos cirrotiska råttor
Summary
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för invasiva mätningar av hemodynamiska parametrar inklusive portal tryck, splanchnic blodflödet och systemiska hemodynamiken för att karakterisera den portal hypertensiv syndromet hos råttor.
Abstract
Detta är en detaljerad protokoll som beskriver invasiva hemodynamiska mätningar hos cirrotiska råttor för karakterisering av portal hypertensiv syndrom. Portal hypertension (PHT) på grund av cirros är ansvarig för de mest allvarliga komplikationerna hos patienter med leversjukdom. En fullständig bild av portal hypertensiv syndrom kännetecknas av ökat portal tryck (PP) på grund av den ökade intrahepatisk kärlmotstånd (IHVR) och hyperdynamic omsättning ökade splanchnic blodflödet. Progressiv splanchnic arteriell vasodilatation och ökad hjärtminutvolym med förhöjd puls (HR) men låga artärtryck karakteriserar den portal hypertensiv syndromet.
Nya terapier för närvarande utvecklas som syftar till att minska PP av antingen inriktning IHVR eller ökat splanchnic blodflöde — men biverkningar på systemiska hemodynamiken. Således en detaljerad karakterisering av portalen venös, splanchnic och systemiska hemodynamiska parametrar, inklusive mätning av PP, portalen venösa blodflödet (PVBF), mesenteriska arteriella blodflödet, genomsnittliga arteriella trycket (karta) och HR behövs för prekliniska utvärdering av effekten av nya behandlingar för PHT. Vår video artikel ger läsaren med ett strukturerat protokoll för att utföra invasiva hemodynamiska mätningar hos cirrotiska råttor. I synnerhet vi beskriver kateterisering av femoralartären och portalen ven via ett ileocolic ven och mätning av portalen venös och splanchnic blodflödet via perivaskulär Doppler-ultraljud flöde sonder. Representativa resultat av olika råtta modeller av PHT visas.
Introduction
PHT definieras som patologiskt förhöjt blodtryck i portalen venösa systemet som kan orsaka allvarliga komplikationer hos patienter med cirros såsom variceal blödning och ascites1. Även före leverfunktion (t.ex., vena portae) och efter leverfunktion (t.ex., Budd-Chiari syndrom) PHT är sällsynta, intrahepatisk PHT på grund av skrumplever utgör den vanligaste orsaken till PHT2.
I skrumplever ökar PP primärt till följd av förhöjda IHVR3. I avancerade stadier, PHT förvärras av den ökande PVBF på grund av ökad hjärtminutvolym och minskade systemisk och splanchnic kärlmotstånd — definiera de portal hypertensiv syndrom4. Ohms lag (ΔP = Q * R) innebär att IHVR och blod flödet är proportionell till PP5. Hos patienter är direkt mätning av PP riskabelt och inte rutinmässigt utförs; i stället används den nedsatt venösa tryckgradienten (HVPG) som ett indirekt mått på PP6,7. HVPG beräknas genom att subtrahera gratis nedsatt venös trycket (FHVP) från inklämd nedsatt venös trycket (WHVP), som mäts med hjälp av en ballongkateter som placeras i en nedsatt ven8. Den fysiologiska HVPG varierar mellan 1 – 5 mmHg, medan en HVPG ≥10 mmHg definierar kliniskt signifikant portal hypertoni (CSPH) och indikerar ökad risk för PHT-relaterade komplikationer, såsom variceal blödning, ascites och leverencefalopati9 . Även om PP (dvsHVPG) är den mest relevanta parametern för PHT svårighetsgrad, information om andra komponenter i PHT, inklusive svårighetsgraden av hyperdynamic omsättning (HR, karta), är splanchnic/mesenterica arteriella blodflödet och IHVR, kritiska till Skaffa en omfattande förståelse av olika underliggande mekanismen av PHT.
Således, i motsats till indirekta mätningar av PP i människor, introducerade metoden för råttor erbjuder fördelen av en direkt mätning av PP och tillåter inspelning av ytterligare hemodynamiska parametrar som kännetecknar den portal hypertensiv syndromet. Dessutom direkt mätning av PP är en utmärkt integrativ avläsning av leverfibros (avgörande betydelse för IHVR) och övervinner vissa begränsningar av fibros kvantifiering relaterade till levervävnad urvalsfel.
De vanligaste gnagare modellerna av cirrotiska PHT inkluderar kirurgiska gallgången ligatur (BDL), toxin inducerad leverskada (dvs.av koltetraklorid, thioacetamide eller dimethylnitrosamine administration) och kost-inducerad metabolisk lever sjukdomsmodeller. Prehepatic (icke-cirrotiska) PHT kan induceras av partiell portvenen ligatur (PPVL)10.
Små gnagare lämpar sig väl för denna metod, inklusive möss, hamstrar, råttor eller kaniner, och associeras med relativt låga underhållskostnader. Trots detta ses alla de hemodynamiska bedömningarna är möjlig att utföra i möss, bättre noggrannhet och reproducerbarheten av resultaten med råttor eller större gnagare på grund av den uppenbara fördelen med djurens storlek. Dessutom behövs särskilda mikro-instrument och enheter att få liknande hemodynamiska parametrar hos möss. Slutligen, råttor är mer robust med lägre associerade sjuklighet och dödlighet och således de i förtid sannolikt lägre hos råttor än hos möss.
Den presenterade metoden är väl lämpad för att utvärdera specifika behandlingar leversjukdom (dvs, anti fibrotiska eller antiinflammatoriska läkemedel) eller roman farmakologiska närmar sig det inflytande kärltonus och/eller endotelceller biologi; och således sannolikt effekt hemodynamiska parametrar i PHT.
Protocol
Representative Results
Discussion
PP är den viktigaste resultat parametern för utvärdering av portal hypertensiv syndrom och återspeglar svårighetsgraden av underliggande cirrhos. Både matrix nedfall (dvs, fibros) och sinusformade vasokonstriktion (beror på ökat nedsatt uttryck av kärlsammandragande medel och minskat lyhördhet för vasodilaterare) orsakar ökad IHVR. Vikten av PP och dess inverkan på kronisk leversjukdom har visats i flera prekliniska11,12,<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar de veterinärer, sjuksköterskor och djurhållare vid Center för biomedicinsk forskning för deras fortsatta stöd under våra projekt. Författarna erkänner viktig input av alla recensioner av detta protokoll. Några av forskningen finansierades av ”Young Science Award” av det österrikiska samhället för gastroenterologi och hepatologi (ÖGGH) till PS och ”Skoda Award” av den österrikiska Society of Internal Medicine i TR.
Materials
| Instruments | |||
| LabChart 7 Pro software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Software |
| ML870 PowerLab 8/30 | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Electronic multichannel recorder |
| MLT0380/D | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure) |
| ML112 Quad Bridge Amplifier | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Bridge amplifier |
| TS420 | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | - | Flowmeter module |
| Biological Research Apparatus 7025 | UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy | - | Ventilator |
| Vapor 2000 | Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany | - | Isofluran Vaporizer |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA1PRB | Ultrasonic flow probe (1mm) |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA2PSB | Ultrasonic flow probe (2mm) |
| 1st for intubation & 2nd for clean skin incisions | - | - | Mayo scissor [x2] |
| Metzenbaum scissor | - | - | - |
| Cuticle scissor | - | - | - |
| e.g. Adson Brown tissue forceps | - | - | Tissue Forceps |
| High precision 45° angle broad point forceps [x2] | - | - | - |
| Hemostat [x4] | - | - | - |
| e.g. Mikulicz peritoneal clamp | - | - | Curved clamp |
| e.g. Dieffenbach clamp | - | - | Micro clamp |
| e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm, | - | - | Micro metal spatula |
| for transbuccal suture at intubation | - | - | Needle holder |
| Scalpel grip | - | - | - |
| selfmade | - | - | Intubation desk |
| blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow | - | - | Blunt steel wire |
| modified arterial line 20G with Flowstich | Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK | #682245 | Arterial line |
| Heating pad | - | - | - |
| Rectal temerature probe | - | - | - |
| Saline heater | - | - | - |
| Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat) | - | - | - |
| Inductionbox for inhalation anesthesia | - | - | - |
| Scale (able to measure mg) | - | - | - |
| Hair clipper | - | - | - |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden | #393230 | Peripheral venous catheter (14G) |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, | Smiths Medical International Ltd., Kent, UK | #800/100/200 | Catheter tube (PE-50) |
| e.g. Omnifix-F Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #9161406V | Syringe 1mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606051V | Syringe 5mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606205V | Syringe 20mL |
| e.g. BD Microlance 3, 18G – 1 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304622 | Cannula (18G) |
| e.g. BD Microlance 3, 23G – 1" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #300800 | Cannula (23G) |
| e.g. BD Microlance 3, 30G – 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304000 | Cannula (30G) |
| e.g. Leukoplast S | BSN medical GmbH, Hamburg, Germany | #47619-00 | Adhesive tape |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10972 | Gauze compress (small) |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10961 | Gauze compress (big) |
| Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 | SMI AG, St. Vith, Belgium | #2021-04 | Suture (Silk 4/0, EP 1.5) |
| e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime | Johnson & Johnson Medical GmbH – Ethicon Deutschland, Germany | #EH7552 | Transbuccal suture |
| e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) | Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany | #967936 | Cotton buds |
| e.g. Vue Ultrasoundgel | Optimum Medical Limited, UK | #1157 | Ultrasound gel |
| e.g. Glubran 2 | Gem srl, Viareggio, Italy | #G-NB2-50 | Tissue glue |
| e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 – carbon steel | Swann-Morton, England, B.S. | #202 | Scalpel Knife |
| Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) | Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria | - | Heparin |
| Florane | Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK | - | Isoflurane |
| OeloVital (5g) | Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria | - | Eye gel |
| Ketasol | aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany | - | Ketamine |
| Rompun | Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria | - | Xylazine |
| Xylocain 10% Pumpspray | AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria | - | Lidocaine pump spray |
| Dipidolor | Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria | - | Piritramide |
| NaCl 0.9% Fresenius, 1L | Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria | #13LIP132 | Physiological saline solution |
Riferimenti
- Ripoll, C., et al. Hepatic venous pressure gradient predicts clinical decompensation in patients with compensated cirrhosis. Gastroenterology. 133 (2), 481-488 (2007).
- Bosch, J., Groszmann, R. J., Shah, V. H. Evolution in the understanding of the pathophysiological basis of portal hypertension: How changes in paradigm are leading to successful new treatments. J Hepatol. 62, S121-S130 (2015).
- Blachier, M., Leleu, H., Peck-Radosavljevic, M., Valla, D. C., Roudot-Thoraval, F. The burden of liver disease in Europe: a review of available epidemiological data. J Hepatol. 58 (3), 593-608 (2013).
- Colle, I., Geerts, A. M., Van Steenkiste, C., Van Vlierberghe, H. Hemodynamic Changes in Splanchnic Blood Vessels in Portal Hypertension. Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 699-713 (2008).
- Laleman, W., Van Landeghem, L., Wilmer, A., Fevery, J., Nevens, F. Portal hypertension: from pathophysiology to clinical practice. Liver International. 25 (6), 1079-1090 (2005).
- Franchis, R. d. . Updating Consensus in Portal Hypertension: Report of the Baveno III Consensus Workshop on definitions, methodology and therapeutic strategies in portal hypertension. Journal of Hepatology. 33 (5), 846-852 (2000).
- Zardi, E. M., Di Matteo, F. M., Pacella, C. M., Sanyal, A. J. Invasive and non-invasive techniques for detecting portal hypertension and predicting variceral bleeding in cirrhosis: a review. Annals of medicine. 46 (1), 8-17 (2014).
- Kumar, A., Sharma, P., Sarin, S. K. Hepatic venous pressure gradient measurement: time to learn. Indian J Gastroenterol. 27 (2), 74-80 (2008).
- Tsochatzis, E. A., Bosch, J., Burroughs, A. K. Liver cirrhosis. Lancet. 383 (9930), 1749-1761 (2014).
- Abraldes, J. G., Pasarín, M., García-Pagán, J. C. Animal models of portal hypertension. World Journal of Gastroenterology : WJG. 12 (41), 6577-6584 (2006).
- Reiberger, T., et al. Sorafenib attenuates the portal hypertensive syndrome in partial portal vein ligated rats. Journal of Hepatology. 51 (5), 865-873 (2009).
- Schwabl, P., et al. Pioglitazone decreases portosystemic shunting by modulating inflammation and angiogenesis in cirrhotic and non-cirrhotic portal hypertensive rats. Journal of Hepatology. 60 (6), 1135-1142 (2014).
- Reiberger, T., et al. Nebivolol treatment increases splanchnic blood flow and portal pressure in cirrhotic rats via modulation of nitric oxide signalling. Liver International. 33 (4), 561-568 (2013).
- Schwabl, P., et al. The FXR agonist PX20606 ameliorates portal hypertension by targeting vascular remodelling and sinusoidal dysfunction. Journal of Hepatology. 66 (4), 724-733 (2017).
- Mandorfer, M., et al. Sustained virologic response to interferon-free therapies ameliorates HCV-induced portal hypertension. J Hepatol. 65 (4), 692-699 (2016).
- Schwabl, P., et al. Interferon-free regimens improve portal hypertension and histological necroinflammation in HIV/HCV patients with advanced liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 45 (1), 139-149 (2017).
- Reiberger, T., Mandorfer, M. Beta adrenergic blockade and decompensated cirrhosis. Journal of Hepatology. 66 (4), 849-859 (2017).
- Reiberger, T., et al. Carvedilol for primary prophylaxis of variceal bleeding in cirrhotic patients with haemodynamic non-response to propranolol. Gut. 62 (11), 1634-1641 (2013).
- Reiberger, T., et al. Austrian consensus guidelines on the management and treatment of portal hypertension (Billroth III). Wiener klinische Wochenschrift. 129 (3), 135-158 (2017).
- de Franchis, R. Expanding consensus in portal hypertension. Journal of Hepatology. 63 (3), 743-752 (2015).
- Pinter, M., et al. The effects of sorafenib on the portal hypertensive syndrome in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma – a pilot study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 35 (1), 83-91 (2012).
- Schwabl, P., Laleman, W. Novel treatment options for portal hypertension. Gastroenterol Rep (Oxf). 5 (2), 90-103 (2017).
- Klein, S., Schierwagen, R., Uschner, F., Trebicka, J. . Mouse and Rat Models of Induction of Hepatic Fibrosis and Assessment of Portal Hypertension. , (2017).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Langhans, W., Myrtha, A., Riediger, T., Lutz, T. A. . Routine animal use procedures. , (2016).
- Animal Care and Use Program. . Rat and Mouse anesthesia and analgesia: Formulary and General Drug Information. , (2016).
- Davis, J. A. . Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Veterinary Research. 10 (1), 198 (2014).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat. Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).
- Becker, K., et al. . Statement on anesthesia methodologies: Recommondations on anaesthesia methodologies for animal experimentation in rodents and rabbits. , (2016).
