Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Summary

Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.

Abstract

Molti geni sono espressi nel cervello embrionale, e alcuni di loro sono continuamente espresso nel cervello dopo la nascita. Per tali geni espressi in modo persistente, possono funzionare per regolare il processo di sviluppo e/o funzione fisiologica nel cervello neonatale. Per indagare le funzioni neurobiologiche di specifici geni nel cervello, è essenziale che inattivano geni nel cervello. Qui, descriviamo un semplice metodo stereotassica per inattivare l'espressione genica nel corpo striato di topi transgenici alle finestre temporali neonatale. AAV-eGFP-Cre virus erano microiniettati nello striato di topi Ai14 reporter gene al giorno postnatale (P) 2 di chirurgia stereotassica cerebrale. L'espressione di gene reporter tdTomato è stata rilevata nello striatum P14, suggerendo che un successo Cre-loxP mediato ricombinazione del DNA in cellule trasdotte AAV striatali. Abbiamo validato ulteriormente questa tecnica da microinjecting virus AAV-eGFP-Cre nei topi P2Foxp2^fl/fl . Doppia etichettatura di GFP e Foxp2 ha mostrato che le cellule GFP-positive mancavano immunoreactivity Foxp2 nello striatum P9, suggerendo la perdita della proteina Foxp2 in cellule striatali AAV-eGFP-Cre trasformata. Presi insieme, questi risultati dimostrano un'efficace eliminazione genetica da stereotassicamente iniettati virus AAV-eGFP-Cre in specifiche popolazioni neuronali nel cervello neonatale di topi transgenici floxed. In conclusione, la nostra tecnica stereotassica fornisce una piattaforma facile e semplice per manipolazione genetica in cervelli di topo neonatale. La tecnica non può essere utilizzata solo per eliminare geni in regioni specifiche del cervello neonatale, ma può essere utilizzato anche per iniettare droghe farmacologiche, traccianti neuronali, geneticamente optogenetica e proteine chemogenetics, indicatori di attività neuronale e altri reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse.

Introduction

Moderni studi sulla struttura e funzione del cervello di solito richiedono manipolazione genetica di specifici geni nelle cellule neuronali. Per sondare le funzioni dei geni differenti, topi transgenici portatori di alleli mutanti, tra cui knockout e knock-in alleli sono stati generati regolarmente. Chirurgia stereotassica cerebrale per roditori adulti è un metodo standard per fornire localmente farmaci, virus, traccianti e altri reagenti a specifiche regioni del cervello del roditore^1,2. Applicando la chirurgia stereotassica cervello di topi transgenici permette di manipolare geneticamente la funzione del gen....

Protocol

I protocolli degli animali descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso comitati della National Yang-Ming University.

1. preparazione del supporto per cuccioli neonatali nell'apparato stereotassica

1. Rendere il vassoio testa: tagliare il fondo di una provetta da centrifuga da 1,5 mL (15 mm di lunghezza) nella forma che si adatta alla testa dei cuccioli neonatale rimuovendo 1/5 della parete del tubo.
2. Una casella di punta della pipetta con la giusta dimensione che si adatta con il piedistallo dell'apparato stereotassiche e rimuovere il coperchio superiore. Apporre il vassoio testa preparato nel passaggio....

Results

Per il primo set di esperimento, abbiamo microiniettati 200 nL di AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, diluizione 1: 10 in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) che esprimono la ricombinasi Cre DNA fusi con GFP in P2 striato di topi Ai14. I topi Ai14 rapidi tdTomato gene reporter all'omissione Cre-mediata di loxP-fiancheggiato (floxed) fermata cassetta (Figura 2F). I cervelli sono stati raccolti presso P14 per immunostaining.......

Discussion

Nello studio presente, dimostriamo un metodo semplice e affidabile stereotassica per iniettare il virus AAV nello striato del cervello di topo neonatale. Abbiamo microiniettati virus AAV-eGFP-Cre nello striato di topi reporter Ai14 a P2 e poi analizzata l'espressione del gene reporter presso P14. Abbiamo trovato che AAV trasdotte cellule GFP-positive in tutto il corpo striato a rostrocaudal livelli. Inoltre, quasi tutte le cellule GFP-positive co-espressi il gene reporter di tdTomato in cellule striatali, suggerendo una .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G PrecisionGlide Ago	Becton Dickinson	REF 305106
Cloroformio	JT Baker	9180-03
Hamilton MICROLITRO Siringa	Hamilton	80300	30G ago adatto per tubo PE10; l'ago 26G necessita di un adattatore PE20
Tubo in polietilene PE20	Becton Dickinson	427406
Tubo in polietilene PE10	Becton Dickinson	427401
Micro portata Pompa a siringa	Pompa di precisione più lunga Co.	TJ-2A (controller) e L0107-2A (unità di azionamento)
Siringa 25G	Becton Dickinson	REF 302105
Verde veloce	Sigma-Aldrich	F-7252	0,1%
Strumenti stereotassici standard	RWD Life Science	68037	Senza l'utilizzo di 68030 Adattatore per topo/ratto neonatale Anticorpo
anti-FOXP2	Abcam	ab16046	Coniglio policlonale per FOXP2, 1:4.000
Anticorpo anti-RFP	Abcam	ab65856	Monoclonale di topo a RFP, microscopio 1:1.000
BX63	Olympus	BX63
LSM 880	Zeiss	LSM 880
Capra anti-coniglio coniugato Alexa fluor594	Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.	111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-9-PV1848	Lotto # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP	AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan	N/A	1x1014 (GC/ml)
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Il Jackson Labtorary	007914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	Il labtorario di Jackson	026259	Foxp2fl/fl
Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato	Corning  cellularegro	21-030-CVR