Plastisitet av kjernefysiske arkitektur styres av dynamisk epigenetic mekanismer, inkludert ikke-koding RNAs, DNA metylering, nucleosome reposisjonering samt histone komposisjon og modifisering. Her beskriver vi en Formaldehyde-Assisted isolasjon av regulatoriske elementer (FAIRE)-protokoll som tillater fastsetting av chromatin tilgjengelighet i en reproduserbare, billig og enkel måte.
Aktuelle genuttrykk svar ekstracellulære Stikkordene, dvs vev – og avstamning-spesifikk genet transkripsjon, avhenger kritisk høyt angitte stater chromatin organisasjon. Det drivkraft arkitekturen av kjernen styres av flere mekanismer og figurer transcriptional utgang programmene. Derfor er det viktig å fastslå locus-spesifikke chromatin tilgjengelighet på en pålitelig måte som helst uavhengig av antistoffer, som kan være et potensielt forvirrende kilde til eksperimentell variasjoner. Chromatin tilgjengelighet kan måles ved ulike metoder, inkludert Formaldehyde-Assisted isolasjon av regulatoriske elementer (FAIRE) analysen, at fastsetting av de generelle chromatin tilgjengelighet i et relativt lavt antall celler. Her beskriver vi en FAIRE protokoll som tillater enkel, pålitelig og rask identifikasjon av genomisk områder med en lav protein innkvartering. I denne metoden DNA covalently bundet til chromatin proteiner med formaldehyd som crosslinking agent og skåret i små stykker. Gratis DNA er etterpå beriket med fenol: kloroform utvinning. Forholdet mellom gratis DNA bestemmes av kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) eller DNA sekvensering (DNA-seq) sammenlignet med en kontroll prøven representerer totalt DNA. Regionene med en løsere chromatin er anriket på gratis DNA prøve, slik at identifikasjon av genomisk regioner med lavere chromatin komprimering.
Genomic DNA av eukaryote celler er tett pakket inn i nucleosomes, som må bli fjernet eller ombygd for å tillate samspillet av andre proteiner med DNA. Transcriptional aktivering av et gen vanligvis fører til en mer åpen konfigurasjon av nucleosomal strukturen, spesielt i 1 nucleosome1, for å lette transkripsjon av RNA polymerase. Også forekomme regulatoriske regioner som arrangører og enhancers dynamiske endringer i deres chromatin tilgjengelighet slik at samspillet med chromatin bestemmelsesord eller transkripsjon faktorer2. Flere tilnærminger har blitt utviklet for å identifisere disse nucleosome-fri regioner. Disse inkluderer følsomheten til nucleases som DNase jeg3 eller micrococcal nuclease4, som bare tilgang DNA når det ikke er tett pakket rundt nucleosomes. Andre metoder for identifikasjon av åpne chromatin eller gratis DNA inkluderer transposase-mediert integrering av retrotransposable elementer (analysen for Transposase tilgjengelig Chromatin, ATAC)5eller chromatin immunoprecipitation (ChIP) bruker antistoffer mot histones. Metoden FAIRE er ikke basert på kapasiteten til et enzym å nå DNA eller binding av et antistoff til et bestemt protein, men i stedet avhengig rensing av nucleosome-fri regioner av en fenol: kloroform utvinning6,7. I denne metoden DNA er covalently bundet til chromatin proteiner ved crosslinking agent formaldehyd og er skåret etterpå til små biter av sonication. Tett pakket chromatin områder vil ha rikelig DNA/protein krysskoblinger, mens DNA regioner med ingen eller få nucleosomes vil ha liten eller ingen krysskoblet DNA/protein komplekser. En fenol: kloroform utvinning renser den ikke-krysskoblet gratis DNA i den vandige fasen, mens DNA krysskoblet proteiner er fanget i organisk fenol fase eller vandig-organisk interphase sammen med proteiner. Kvantifisering av denne gratis DNA sammenlignet med en referanse til totalt DNA-prøve kan identifikasjon av regionene chromatin gratis. FAIRE metoden kan brukes for karakterisering av genomisk enkeltområder som beskrevet her, men passer også for identifikasjon av genomet hele chromatin tilgjengelighet når koplet til dyp sekvensering som beskrevet i ulike modeller8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultatene av FAIRE-seq og andre metoder som ATAC-seq er i stor grad overlappende14. Metoden FAIRE er en meget robust, billig og lett å utføre metoden for å identifisere nucleosome-fri områder. I motsetning til andre metoder, det krever ikke piloten eksperimenter for å bestemme riktig nivå av fordøyelsen som kreves for nucleases (DNase-seq, MNase-seq) eller transposases (ATAC-seq) og diskutert i detalj i en siste gjennomgang15. Parameterne bare justeres er sonication forhold og i noen tilfeller fiksering tiden. Dette dokumentet beskriver en enkel protokoll som skjematisk vises i figur 1 , og som ikke krever spesialutstyr enn en sonicator. Protokollen kan utføres i en rimelig kort tid og gjør FAIRE en enkel og pålitelig metode for å teste chromatin tilgjengelighet i en rekke ulike celletyper mellom lungekreft cellene11 primære celler fra musen lever16.
FAIRE er en robust og rimelig metode slik at identifisering av nucleosome-fri regioner. Den er basert på prinsippet om at DNA pakket rundt nucleosomes lett kan krysskoblet til histones. En fenol: kloroform utvinning brukes til å skille ikke-krysskoblet og protein-gratis DNA fragmenter fra protein-bundet DNA, som ligger i nedre fenol fase og i noen grad interphase (figur 1). Derfor er nucleosome-fri regionene overrepresentert i fraksjonen av gratis DNA i den vandige fasen. En rekke publikasjoner beskriver detaljert protokoller av FAIRE. metode23,24,25,26, som kan bli konsultert for å utfylle fremgangsmåten som er beskrevet her.
I likhet med andre metoder for å bestemme chromatin strukturen, FAIRE metoden også kritisk avhenger optimal klipping av DNA. Hvis fragmenter er for lang, vil en nucleosome-fri region være maskert av tilstøtende chromatin-bundet DNA. Hvis fragmenter er for små, blir gjenkjenning av qPCR eller dyp sekvensering svært vanskelig. Derfor sonication av DNA er en viktig parameter som må kontrolleres og optimalisert for å få fragmenter rundt 200-300 bp lengde, som representerer 1-2 nucleosomes (Figur 4).
En annen parameter som kan påvirke sluttresultatet er crosslinking av utvalget. Selv om fiksering fremgangsmåten som er beskrevet her er gyldig for de fleste cellelinjer, forskeren må nøye vurdere dette trinnet for bestemt prøven under studien, særlig når benytter vev, hvor lengre fiksering ganger kan være nødvendig å tillate den formaldehyd å nå cellene i alle Vevsprøve.
I motsetning til andre metoder, for eksempel DNase jeg eller micrococcal nuclease overfølsomhet, ChIP eller ATAC, FAIRE ikke stole på en enzymatisk aktivitet eller spesifikke antistoffer, og derfor det trenger ikke titrering eller optimalisering av reaksjonen. Dette gjør FAIRE en ideell metode for å måle chromatin tilgjengelighet for labs med liten erfaring i feltet chromatin. I tillegg piloten eksperimenter er kun nødvendig for å optimalisere DNA klipping trinn og crosslinking tiden, når det er nødvendig.
Metoden ble opprinnelig utviklet i gjær6, men det har også blitt utvidet til pattedyrceller. DNA renset med FAIRE metoden kan brukes for dype sekvensering, slik at genomet hele karakterisering av chromatin status. Dette har allerede vist seg nyttig i en rekke studier8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Resultater fra FAIRE-seq eksperimenter viser et stort overlapp med resultatene av andre metoder som DNase-seq14, selv om noen differanser. Dette er på grunn av metodologiske forskjeller som for eksempel avslappet eller ombygd nucleosomes kan fortsatt hindre spalting av DNase jeg, mens disse DNA-områder vil være mindre utsatt for produserer DNA/protein krysskoblinger og dermed ville bli fastsatt som nucleosome-fri områder med FAIRE9. Også ikke-histone proteiner som RNA polymerases eller leser proteiner for epigenetic merker kan resultere i DNA/protein krysskoblinger og dermed ville bli tolket som protein-pakket områder FAIRE eksperimenter. Disse begrensningene er iboende til hver metode som brukes til fastsettelse av chromatin staten, dermed øke behovet for å bruke en kombinasjon av ulike metoder for å få en omfattende innsikt.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Tilman Borggrefe (Universitetet i Giessen) for vennlig deler sonication enheten. Arbeidet M.L.S. støttes av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence klynge Cardio-pulmonal systemet (ECCPS, EXC 147/2), Deutsche Krebshilfe (111447) og IMPRS-HLR programmet av Max-Planck Society.
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
Leupeptin | Sigma | L8511 | |
Aprotinin | Sigma | A1603 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |