Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

Summary

De praktische toepassing en de prestaties van methoden voor generatie van representatieve weefselmonsters van varkens diermodellen voor een breed spectrum van downstream analyses in biobank projecten worden gedemonstreerd, waaronder volumetrie, systematische steekproefsgewijze bemonstering, en differentiële verwerking van weefselmonsters voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van morfologische en moleculair typen.

Abstract

Translationeel medisch onderzoek, varkens modellen steeds populairder geworden. Gezien de hoge waarde van individuele dieren, met name van genetisch gemodificeerde varken modellen, en de vaak beperkte aantal beschikbare dieren van deze modellen, oprichting van (biobank) collecties van voldoende verwerkte weefselsteekproeven geschikt voor een breed spectrum van latere analyses methodes, inclusief analyses niet opgegeven op de tijdstip van monsterneming, vertegenwoordigen zinvolle benaderingen ten volle te profiteren van de translationeel waarde van het model. Met betrekking tot de eigenaardigheden van varkens anatomie, zijn onlangs uitgebreide richtsnoeren opgesteld voor gestandaardiseerde generatie representatief, kwalitatief hoogwaardige monsters van andere varkens organen en weefsels. Deze richtsnoeren zijn essentiële voorwaarden voor de reproduceerbaarheid van de resultaten en hun vergelijkbaarheid tussen de verschillende studies en onderzoekers. De opname van basisgegevens, zoals orgel gewichten en volumes, de bepaling van de locaties van de bemonstering en de nummers van weefselmonsters moeten worden gegenereerd, evenals hun geaardheid, grootte, verwerking en trimmen richtingen, zijn relevante factoren het bepalen van de dan en de bruikbaarheid van het model voor moleculaire, kwalitatieve en kwantitatieve morfologische analyses. Hier, een illustratieve, praktische, stapsgewijze demonstratie van de belangrijkste technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multifunctionele biobank specimen van varkens weefsels wordt gepresenteerd. De hier beschreven methoden bepaling te omvatten van orgaan/weefsel volumes en dichtheden, de toepassing van een systematische steekproeven volume-gewogen procedure voor parenchymal organen door punt-tellen, bepaling van de omvang van weefsel krimp aan de histologische inbedding van monsters en generatie van willekeurig georiënteerde monsters voor kwantitatieve stereological analyses, zoals isotrope uniforme willekeurige (IUR) secties die zijn gegenereerd door de “Oriënteringsapparaten” en “Isector” methoden en verticale uniform gerelateerde willekeurige (VUR) secties.

Introduction

Translationeel geneeskunde, varkens zijn steeds vaker voorkomende voor gebruik als groot dier^1,2,3,4,5, als gevolg van verschillende voordelige overeenkomsten tussen de varkens modellen en menselijke anatomie en fysiologie, en de beschikbaarheid van gevestigde moleculaire biologische methoden toestaan voor generatie op maat, genetisch gemodificeerde varken modellen voor een breed scala van^1,4van de voorwaarden van de ziekte.

Ten opzichte van knaagdier modellen, is het aantal dieren van een respectieve varken model dat kan worden voorzien voor experimenten op elk gewenst moment echter beperkt. Dit is te wijten aan de varkens generatie interval van ongeveer een jaar, en de financiële en tijdrovende inspanningen die nodig zijn voor de generatie van varkens modellen en de veehouderij. Daarom, individuele dieren van een varkens model, evenals de voorbeelden die kunnen worden gegenereerd op basis van deze varkens, zijn zeer waardevol, vooral als genetisch gemanipuleerde varkens modellen en/of lange termijn experimentele problemen (bijvoorbeeld, late complicaties van chronische ziekten) worden in leeftijd individuen^2,6,7onderzocht.

In de loop van een studie, prestaties van aanvullende analyses die had niet gepland in de eerste opzet van de studie kan later blijken te worden betrokken, bijvoorbeeldnaar adres verschillende vragen die voortvloeien uit eerder ontdekt onverwachte bevindingen. Als geschikt monsters voor dergelijke aanvullende experimenten niet beschikbaar zijn, mogelijk onevenredig hoge kosten en tijdrovende uitgaven noodzakelijk voor het genereren van extra varkens en weefselmonsters worden. Als u wilt worden voorbereid dergelijke, generatie van biobank collecties van geconserveerde reservekopie monsters van de verschillende organen, weefsels of bio-vloeistoffen, kwantitatief als in kwalitatief opzicht geschikt zijn voor een breed scala van latere analyses, wordt beschouwd als een belangrijk ^2,6,7te benaderen. Optimale voordelen uit een varkens diermodel voortvloeiende, de beschikbaarheid van voldoende biobank monsters biedt ook de unieke mogelijkheid voor het uitvoeren van een breed spectrum van verschillende analysemethoden op identieke monster materialen op het niveau van een multi-orgel in de precies dezelfde individuele dieren, bijvoorbeelddoor verdeling van de monsters aan wetenschappers van verschillende werkgroepen georganiseerd in een onderzoek netwerk^2,6,7. De ” toekomstgerichte ” bemonsteringsstrategie in biobanking draagt bovendien ook bij aan een vermindering van het aantal dieren in een studie nodig. De voordelen van varkens model biobanking zijn onlangs aangetoond in een multi orgel, multiomics onderzoek, onderzoek van orgel cross talk in een genetisch gemanipuleerde varkens model van lange termijn diabetes mellitus, met behulp van specimens van de München MIDY varken Biobank ².

Er zijn een aantal verplichte eisen biobank monsters in het algemeen voldoen moeten om de betrouwbaarheid en interpretability van de resultatenvan de later uitgevoerde analyses. De monsters moeten reproducibly worden gegenereerd, en ze moet voldoende representatief, dat wil zeggen, als gevolg van de interesse morfologische en moleculaire kenmerken van het weefsel/orgel de monsters werden genomen uit⁷. Om zijn geschikt voor een breed scala van soorten downstream analyse, moeten de monsters worden genomen in voldoende hoeveelheden en verwerkt volgens de eisen (met inbegrip van tijd- en temperatuurdisplays voorwaarden) van de verschillende analysemethoden, met inbegrip van beschrijvende histopathologische analyses, zoals cryohistology, paraffine en kunststof histologie, immunohistochemistry, in situ hybridisatie, ultrastructurele elektronen microscopische analyses en klinisch laboratorium diagnostische analyses, evenals als moleculaire analyses van DNA, RNA, eiwitten en metabolieten.

Als u wilt toestaan voor de beoordeling van een breed scala aan verschillende kwantitatieve morfologische parameters zoals cijfers, volumes, lengtes, of oppervlakten van verschillende weefsel structuren door kwantitatieve stereological analyses, gerandomiseerde sectie vliegtuigen van de histologische monsters van de respectieve organen/weefsels moeten worden voorbereid^7,8,9,10,11. In kwantitatieve morfologische studies, de nauwkeurige bepaling van het totale volume van het weefsel, orgel of orgel compartiment, de monsters werden genomen uit (dat wil zeggen, de verwijzing ruimte) is van cruciaal belang^{7,9 , 12} om de absolute hoeveelheden van de betrokken parameters binnen de respectieve orgaan, weefsel of organisme te berekenen. Uiteindelijk heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de voorbereiding van de histologische secties te worden bepaald en in rekening¹³genomen. Daarom, kwantitatieve stereological analyses, met name van gearchiveerde monsters (vaste weefselsteekproeven ingesloten weefsel blokken, histologisch secties, etc.) uit eerdere studies zijn soms ernstig beperkt of zelfs onmogelijk¹², met name indien volumetrie van de respectieve organen/weefsels is niet uitgevoerd, als geen passende bemonstering ontwerpen werden toegepast om te rechtvaardigen representatieve monsters, wanneer de aantallen en bedragen van de beschikbare afzonderlijke monsters ontoereikend zijn, of als de verwerking van de monsters is incompatibel met de raming van de kwantitatieve morfologische parameter (s) van belang. Vanwege de vele mogelijke factoren, de geschiktheid van archief-monster materialen voor analyses van afzonderlijke kwantitatieve morfologische parameters ondubbelzinnig kan niet worden beantwoord, maar hangt af van de zorgvuldige beoordeling van ieder individueel geval.

Dus, zoals de locatie, grootte, aantal, verwerking, trimmen richting en afdrukstand van monsters zullen mogelijk van invloed zijn op de resultaten van de latere analyses, deze factoren zijn van groot belang en moeten worden beschouwd in het experimentele ontwerp van een onderzoek. Met betrekking tot deze aspecten en de specificiteit van de varkens anatomie, uitgebreide, gedetailleerde, grootschalige bemonstering richtsnoeren aangepast aan varkens dierlijke modellen zijn onlangs vastgesteld, bieden een robuuste verwijzing naar gestandaardiseerde, reproduceerbare , en efficiënt genereren van redundante, adequaat verwerkt, kwalitatief hoogwaardige monsters van meer dan 50 verschillende varkens organen en weefsels^6,7.

De methodologische beschrijvingen en de video-tutorial weergegeven in dit artikel bieden gedetailleerde, illustratieve, begrijpelijk, stap-by stap-instructies voor de praktische uitvoering van een verscheidenheid van technieken voor volumetrie, bemonstering van varkens weefsels en organen, en verwerking van weefselmonsters voor verschillende downstream analysemethoden. De aanbevolen technieken omvatten methoden voor bepaling van orgaan/weefsel volumes en dichtheden gebaseerd op de beginselen van Archimedes en Cavalieri⁹, met inbegrip van de bepaling van de afmetingen van driedimensionale krimp van weefsel gerelateerde aan de insluiten in verschillende insluiten media¹⁴ tijdens de verwerking voor histopathologisch onderzoek, toepassing van uitvoerbaar volume-gewogen systematische steekproeven nadert, verwerking van gesamplede weefsel specimens voor verschillende latere analyses^7,,^8,,^9,15, generatie op passende wijze georiënteerd en verwerkt monsters voor potentiële kwantitatieve stereological analyses^{7,8, 9,10,11}. Naast hun toepassing in varkens biobank projecten zijn de bewezen methoden over het algemeen geschikt voor alle studies kwantitatieve histo-morfologische eigenschappen van organen/weefsels te onderzoeken. Bovendien, systematische steekproeven ontwerpen zijn vooral gunstig voor generatie van representatieve monsters in experimenten moleculaire analysemethoden gebruiken voor het detecteren van overvloed wijzigingen van, bijvoorbeeld, RNAs, eiwitten of metabolieten in verschillende organen en weefsels.

De volgende paragrafen bieden een korte inleiding op deze methoden, terwijl hun praktische prestaties wordt beschreven in de sectie protocol.

Bepaling van orgaan/weefsel volumes
Bepaling van orgel gewichten en volumes is belangrijk in verschillende experimentele instellingen, zoals deze factoren kunnen wijzen op veranderingen, potentieel aan experimenteel gerelateerde onderzocht factoren van belang. Het totale volume van een orgaan/weefsel is ook vaak nodig voor het berekenen van de absolute kwantitatieve parameters (bijvoorbeeld, het nummer van de cel totaal), van stereologically geschatte numerieke volume dichtheden (dat wil zeggen, het aantal cellen per volume-eenheid van weefsel)^7,12. Afgezien van technieken met behulp van complexe technische apparatuur, zoals computer tomografie, zijn er in principe drie praktische methoden die gewoonlijk worden gebruikt om te bepalen van het absolute volume van een orgaan of weefsel. Het volume van een orgaan kan worden bepaald door de “directe volumetrische meting” volgens het beginsel van Archimedes, dat wil zeggen, het meten van de hoeveelheid water of zoutoplossing dakloos geraakt door de structuur als volledig ondergedompeld. Voor relatief grote varkens organen zijn deze benaderingen echter onpraktisch en gevoelig voor onnauwkeurigheid, aangezien ze zeer grote volumetrische/meten kolven vereist. Meer gemakshalve, het volume van een orgaan/weefsel kan worden berekend op basis van haar gewicht en dichtheid^7,12,16, die efficiënt kan worden bepaald met behulp van de “methode van de onderdompeling”^{7,12 ,16} (protocol stap 1.1.). Orgaan/weefsel volumes kunnen ook worden geschat met behulp van volumetrie benaderingen gebaseerd op het “principe van Cavalieri” (1598-1647). In eenvoudige termen, het principe van Cavalieri stelt, als twee objecten zijn gesegmenteerd in vlakken evenwijdig aan een massaplaat, en de profielen van de secties door de twee objecten op overeenkomt gesneden afstanden van de massaplaat zijn dezelfde regio’s, de twee objecten hetzelfde volume hebben. Dus, het volume van willekeurig gevormde objecten kan worden ingeschat als het product van hun sectie profiel gebieden in parallelle, even verre sectie vliegtuigen en de afstand tussen de vlakken van de sectie. Dit is begrijpelijk met de volgende analogie: overwegen twee stapels bestaande uit hetzelfde aantal identieke munten staan naast elkaar, een stapel met de munten ordelijke gestapeld bovenop elkaar opbrengst van een cilindrische vorm van de munt-stack, en de andere stapel van munten met uit het midden geplaatst munten (figuur 3A). Hoewel de vormen van zowel munt-stapels anders zijn, hun volumes zijn hetzelfde, sinds de gebieden van de munten op overeenkomstige niveaus van beide stapels (dat wil zeggen, het gebied van profielen van parallelle secties snijden door beide stapels van de munt in op gelijke afstand van de gemalen) identiek zijn. Schatting van de volumes van varkens organen en weefsels met behulp van de^12,voor Cavalieri principe^7,15 wordt beschreven in stap 1,2.

Bepaling van de omvang van weefsel krimp aan histologische insluiten gerelateerde
In analyses van verschillende kwantitatieve morfologische parameters gemeten in histologische weefselsecties, heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens verwerking voor histologie weefsel te worden bepaald en in aanmerking genomen. De omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp variabele kan worden, en is afhankelijk van zowel op het weefsel, de verwerking en het insluiten middellange^{8,13,17,18,19}. In het algemeen, insluiten-gerelateerde veranderingen van het volume van een sample van het weefsel (dat wil zeggen, meestal krimp) optreden in alle drie de dimensies van ruimte, en dus, is van invloed op alle dimensionale parameters geschat door kwantitatieve stereological analyses⁸ . Kortom, de omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp, uitgedrukt als de lineaire weefsel krimp factor (f_S), kan worden geraamd zoals aangegeven in stap 1.3. en gebruikt voor correctie van de kwantitatieve morfologische parameters (krimp-gevoelig)¹⁴.

Volume-gewogen systematische aselecte steekproef van organen/weefsels
Voor vestiging van een biobank collectie van varkens orgel/weefselsteekproeven, hebben systematische steekproeven volume-gewogen benaderingen zoals beschreven in stap 2 bewezen praktische tijdbesparende en efficiënte technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multi purpose weefsel monsters^7,8,9,15.

Generatie van isotroop uniforme Random secties en verticale uniforme Random secties voor kwantitatieve stereological analyses
Biobank weefselsteekproeven moeten geschikt zijn voor een breed scala van verschillende kwantitatieve stereological analysemethoden voor schatting van een maximum van parameters die kon niet worden vastgesteld zonder een adequaat bereid exemplaar. Bijna alle kwantitatieve stereological parameters kunnen worden bepaald, met behulp van “isotrope (onafhankelijke) uniforme willekeurige (IUR) secties”^8,9. In IUR secties, is de driedimensionale oriëntatie van het sectievlak van het weefsel monster gerandomiseerde. Dit kan worden bereikt door randomisatie van de positie van het weefsel monster ten opzichte van de positie van het sectievlak, zoals toegepast in de “Isector” methode¹¹ (protocol stap 3.1), of door randomisatie van de oriëntatie van het sectievlak ten opzichte de weefsel monster, zoals in de “Oriënteringsapparaten” methode¹⁰ (protocol stap 3.2). In weefselmonsters, zoals huid of mucosa specimen weergeven een nature aanwezig, of gedefinieerde en goed herkenbaar verticale as, voorbereiding van de “verticale uniforme willekeurige (VUR) secties” (protocol stap 3.3.) gesegmenteerd strikt binnen het vlak van hun verticale as is de voordeligste^8,20. Voor een volledige discours van de theoretische grondslagen van IUR/VUR bemonstering en een uitgebreide bespreking van potentiële downstream kwantitatieve stereological analyses, wordt de geïnteresseerde lezer verwezen naar de schoolboeken van kwantitatieve stereology in het leven Wetenschappen^8,9.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven hier gebruik van weefselmonsters afgeleid van dode dieren en volledig in overeenstemming zijn met de Duitse wettelijke voorschriften voor het welzijn van dieren. 1. volumetrie Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel (Figuur 1 en Figuur 2) 7 , 12<…

Representative Results

Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel Figuur 12A -B toont de representatieve bepaling van de dichtheid en het volume van een varkens nier met behulp van de onderdompeling techniek beschreven in stap 1.1 (Figuur 1, Figuur 2). Meer representatieve resultaten van metingen van de dichtheid…

Discussion

Generatie van biobank monstercollecties van varkens diermodellen vereist robuuste technieken en protocollen voor de bepaling van orgaan/weefsel volumes, de reproduceerbare generatie van vertegenwoordiger, redundante weefselsteekproeven geschikt voor een breed scala aan verschillende analysemethoden, en voor randomisatie van de oriëntatie van monster secties voor kwantitatieve stereological analyses. De in dit artikel beschreven methoden zijn aangepast aan de grootte van varkens organen en weefsels, en hebben ontwikkeld …

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.