Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

Summary

Die praktische Anwendung und Leistung der Methoden für die Generation von repräsentativen Gewebeproben von porcinen Tiermodellen für ein breites Spektrum an nachgeschalteten Analysen in Biobank Projekte gezeigt, darunter Volumetrie, systematische Stichproben und differenzierte Aufbereitung von Gewebeproben für qualitative und quantitative morphologische und molekulare Analysen Arten.

Abstract

In der translationalen medizinischen Forschung haben Schweine Modelle stetig populärer geworden. In Anbetracht des hohen Wertes der einzelnen Tiere, besonders der gentechnisch veränderten Schwein, Modelle und oft zeitlich begrenzte Anzahl der verfügbaren Tiere dieser Modelle, Einrichtung (Biobank) Sammlungen von adäquat verarbeiteten Gewebeproben eignet sich für eine breites Spektrum an nachfolgende Analysemethoden, einschließlich nicht angegebene zum Zeitpunkt der Probenahme, Analysen stellen sinnvolle Ansätze für die translationale Wert des Modells voll nutzen. Im Hinblick auf die Besonderheiten des porcinen Anatomie wurden umfassende Richtlinien für standardisierte Generation Vertreter, qualitativ hochwertige Proben aus verschiedenen porcinen Organen und Geweben vor kurzem eingerichtet. Diese Richtlinien sind wesentliche Voraussetzungen für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und ihre Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien und Ermittler. Die Aufzeichnung der Grunddaten wie Orgel Gewichte und Volumina, die Bestimmung der Probenahme Standorte und der Anzahl der Gewebeproben erzeugt werden, sowie Ausrichtung, Größe, Verarbeitung und trimmen Richtungen sind relevante Faktoren Bestimmung der Generalizability und Nutzbarkeit der Probe zur molekularen, qualitative und quantitative morphologische Analysen. Hier ist eine anschauliche, praktische, schrittweise Demonstration der wichtigsten Techniken zur Erzeugung von Vertreter, Mehrzweck-Biobank Exemplar von porcinen Gewebe präsentiert. Die hier beschriebenen Methoden umfassen Bestimmung der Organgewebe/Volumen und Dichte, die Anwendung eines volumengewichteten systematische Stichproben für parenchymatösen Organen durch Punkt zählen, Bestimmung des Ausmaßes der Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit histologische Einbettung der Proben und Generierung von zufällig orientierte Proben für quantitative stereologischen Analysen, z. B. isotrop einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte erzeugt durch die “Orientator” und “Isector” Methoden und vertikale uniform zufällige (VUR) Abschnitte.

Introduction

In der translationalen Medizin, Schweine sind immer häufiger für den Einsatz als großes Tier^1,2,3,4,5, wegen mehrere vorteilhafte Ähnlichkeiten zwischen den Schweinen Modelle und menschliche Anatomie und Physiologie und die Verfügbarkeit von etablierten molekularbiologischen Methoden ermöglichen Generation zugeschnitten, gentechnisch veränderte Schweine-Modelle für ein breites Spektrum von Krankheiten Bedingungen^1,4.

Jedoch beschränkt sich im Vergleich zu Nager-Modelle, die Zahl der Tiere eines jeweiligen Schwein-Modells, das für Experimente jederzeit zur Verfügung gestellt werden können. Dies liegt an den Schweinen Generierungsintervall von ca. einem Jahr und den finanziellen und zeitintensiven Aufwand für die Erzeugung von porcinen Modelle und Tierhaltung. Daher sind einzelne Tiere von porcinen Modell sowie die Proben, die von diesen Schweinen generiert werden können sehr wertvoll, vor allem, wenn gentechnisch veränderte Schweine Modelle und/oder langfristige experimentelle Probleme (z.B., Spätfolgen der chronische Krankheiten) sind Personen im Alter von^2,6,7untersucht.

Im Rahmen einer Studie Leistung weitere Analysen, die nicht in der ersten experimentellen Design der Studie geplant hatte vielleicht später erweisen sich als relevant, z.B.Adresse, verschiedene Fragen, die bisher entdeckt, unerwartete Ergebnisse. Wenn geeignete Beispiele für solche zusätzliche Experimente nicht verfügbar sind, möglicherweise unverhältnismäßig hohe Kosten und zeitintensive Ausgaben erzeugen zusätzliche Schweine und Gewebeproben erforderlich. Um für solche Eventualitäten vorbereitet zu sein, gilt Generation der Biobank Sammlungen von konservierten Back-up Proben von verschiedenen Organen, Geweben oder Bio-Flüssigkeiten, quantitativ und qualitativ geeignet für ein breites Spektrum der nachfolgenden Analysen, eine wichtige Ansatz^2,6,7. Porcines Tiermodell optimale Vorteile ableiten, die Verfügbarkeit von angemessenen Biobank Proben auch bietet die einmalige Möglichkeit zum Ausführen eines breiten Spektrums an verschiedenen Analysemethoden für identische Probematerialien auf einer Multi-Organ-Ebene in der gleichen einzelne Tiere, z. B.durch Verteilung der Proben an Wissenschaftler der verschiedenen Arbeitsgruppen organisiert in einem Forschung Netzwerk^2,6,7. Darüber hinaus trägt die ” vorausschauende ” Probenahmestrategie in Biobanking auch zu einer Verringerung der Anzahl der Tiere in einer Studie erforderlich. Die Vorteile von porcinen Modell Biobanking wurden vor kurzem in einem Multi-Organ, Multiomics Studie, Orgel nachgewiesen Übersprechen in einem genetisch veränderten porcinen Modell des langfristigen Diabetes Mellitus, mit Proben aus München MIDY Schwein Biobank ².

Es gibt einige Anforderungen, die Biobank Proben in der Regel einhalten müssen, um die Zuverlässigkeit und die Interpretierbarkeit der Ergebnisse der anschließend durchgeführten Analysen zu etablieren. Die Proben reproduzierbar erzeugt werden müssen, und sie müssen repräsentativ, d.h.angemessen reflektiert interessierte morphologischen und molekularen Eigenschaften des Gewebes/Organs die Proben^{7 entnommen wurden}. Geeignet für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysetypen werden muss die Proben in ausreichenden Mengen genommen und entsprechend den Anforderungen (einschließlich Zeit und Temperatur) der verschiedenen analytischen Methoden, einschließlich beschreibende verarbeitet werden histopathologische Untersuchungen, wie Cryohistology, Paraffin und Kunststoff Histologie, Immunhistochemie, in Situ Hybridisierung, Ultrastrukturforschung Elektron mikroskopische Analysen und klinische diagnostische Laboranalysen, sowie molekulare Analyse von DNA, RNA, Proteinen und Metaboliten.

Um die Bewertung einer Vielzahl deutliche quantitative morphologische Parameter wie Zahlen, Mengen, Längen oder Flächen unterschiedliche Gewebestrukturen durch quantitative stereologischen Analysen ermöglichen, randomisierte Abschnitt Flugzeuge von der histologische Proben der jeweiligen Organe/Gewebe^7,8,9,10,11vorbereitet werden müssen. In quantitativen morphologische Studien, die präzise Bestimmung des Gesamtvolumens der Gewebe, Organ oder Fach Orgel, die Proben entnommen wurden (d. h., die Referenz-Raum) ist von entscheidender Bedeutung^{7,9 , 12} die absoluten Mengen der interessierten Parameter innerhalb der jeweiligen Organ, Gewebe oder Organismus zu berechnen. Schließlich wirkt Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Vorbereitung der histologischen Abschnitte bestimmt und Konto¹³berücksichtigt werden. Daher sind quantitative stereologischen Analysen, vor allem der archivierten Proben (feste Gewebeproben, eingebettete Gewebe Blöcke, histologische Abschnitte, etc.) aus früheren Studien manchmal stark eingeschränkt oder sogar unmöglich¹², besonders wenn Volumetrie der jeweiligen Organe/Gewebe nicht durchgeführt wurde, wenn keine angemessene Stichproben Designs angewendet wurden, um repräsentative Proben zu rechtfertigen, wenn die Zahlen und Mengen zur Verfügung einzelner Samples nicht ausreichen, oder wenn die Verarbeitung der Proben ist unvereinbar mit der Schätzung des quantitativen morphologische Parameter von Interesse. Aufgrund der vielfältigen möglichen Einflussfaktoren die Eignung der Archiv-Mustermaterialien für Analysen deutliche quantitative morphologische Parameter kann nicht eindeutig beantwortet werden, aber die sorgfältige Beurteilung des Einzelfalls abhängig.

So wie die Lage, Größe, Anzahl, Verarbeitung, trimmen Richtung und Ausrichtung der Proben die Ergebnisse der nachfolgenden Analysen betreffen werden, diese Faktoren sind von großer Bedeutung und müssen in den Versuchsplan Studie betrachtet werden. Im Hinblick auf diese Aspekte und Besonderheiten der porcinen Anatomie, umfassende, detaillierte und umfangreiche Sampling-Richtlinien angepasst porcinen Tiermodelle vor kurzem eingerichtet wurden, bieten einen robuste Verweis auf standardisierte, reproduzierbare , und effiziente Erzeugung von redundanten, adäquat verarbeitet, hochwertige Proben aus mehr als 50 verschiedene porcinen Organen und Geweben^6,7.

Die methodischen Beschreibungen und das video-Tutorial gezeigt in diesem Artikel bieten detaillierte, anschauliche, verständliche, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für praktische Leistung eine Vielzahl von Techniken für die Volumetrie, Beprobung von porcinen Gewebe und Organe und Verarbeitung von Gewebeproben nach verschiedenen nachgeschalteten Analysemethoden. Die vorgestellten Techniken gehören Methoden zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen und Dichte basierend auf den Prinzipien von Archimedes und Cavalieri⁹, einschließlich der Bestimmung der Abmessungen der dreidimensionalen Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit der Einbettung in verschiedenen Einbetten von Medien¹⁴ während der Verarbeitung für histologische Untersuchung, Anwendung von praktikablen volumengewichteten systematische Stichproben nähert, Verarbeitung von gesampelten Gewebemustern für verschiedene spätere Analysen^7,8,9,15und Generation entsprechend orientiert und Beispiele für mögliche quantitative stereologischen Analysen^{7,8verarbeitet, 9,10,11}. Neben ihrer Anwendung in porcinen Biobank Projekte eignen sich die Methoden in der Regel für alle Studien, die quantitative Histo-morphologische Eigenschaften der Organe/Gewebe. Darüber hinaus sind systematische Stichproben Entwürfe besonders vorteilhaft für die Erzeugung von repräsentativen Proben bei Experimenten mit molekulare Analysemethoden Fülle Änderungen, z. B., RNAs, Proteine oder Metaboliten in erkennen verschiedenen Organen und Geweben.

Die nächsten Absätze geben eine kurze Einführung in diese Methoden während ihrer praktischen Leistung im Abschnitt Protokoll beschrieben wird.

Bestimmung der Organgewebe/Volumen
Bestimmung der Orgel Gewichte und Volumina ist wichtig in mehrere experimentelle Einstellungen, wie diese Faktoren könnte darauf hindeuten Änderungen, die möglicherweise im Zusammenhang mit experimentell untersucht Faktoren von Interesse. Das Gesamtvolumen der ein Organ/Gewebe ist häufig auch erforderlich, um absolute quantitative Parameter (z.B., die gesamte Zellzahl), von stereologically geschätzten numerische Volumen Dichte (d. h., die Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit zu berechnen des Gewebes)^7,12. Neben Techniken mit komplexen technischen Ausstattung, wie die Computertomographie gibt es grundsätzlich drei praktische Methoden häufig verwendet, um das absolute Volumen eines Organs oder Gewebes bestimmen. Das Volumen eines Organs kann durch “direkte volumetrische Messung”, nach dem Prinzip des Archimedes, d. h., Messung des Volumens von Wasser oder Kochsalzlösung verdrängt durch die Struktur als völlig untergetaucht ermittelt werden. Sind jedoch vergleichsweise große Schweine Organe, diese Ansätze unpraktisch und fehleranfällig Ungenauigkeit, da sie sehr große volumetrische/Messung Flaschen erfordern. Bequemer, kann die Lautstärke von einem Organ/Gewebe aus Gewicht und Dichte^7,12,16, berechnet die effizient ermittelt werden können, mit dem “eintauchen-Methode”^{7,12 ,16} (Protokoll Schritt 1.1.). Organgewebe/Mengen können auch mit Volumetrie Konzepte basieren auf dem “Prinzip von Cavalieri” (1598 – 1647) geschätzt werden. In einfachen Worten das Prinzip von Cavalieri heißt es, wenn zwei Objekte in Ebenen parallel zu einer Grundebene geschnitten sind, und die Profile der Abschnitte durch die beiden Objekte an entsprechenden geschnitten Entfernungen von der Bodenebene haben die gleichen Bereiche, die zwei Objekte haben Sie das gleiche Volumen. So kann das Volumen der beliebig geformte Objekte als das Produkt der ihre Profilbereiche der Abschnitt in parallel, gleich weit entfernt Schnittebenen und der Abstand zwischen der Schnittebenen geschätzt werden. Dies ist verständlich mit die folgende Analogie: betrachten zwei Stapel, bestehend aus der gleichen Anzahl von identischen Münzen sind nebeneinander, einen Stapel mit den Münzen ordentlich übereinander nachgeben eine zylindrische Form des Stapels Münze, und die andere Stapel von Münzen mit außermittig positioniert Münzen (Abb. 3A). Die Formen der beiden Münze-Stacks sind, zwar unterschiedlich deren Volumen sind die gleichen, da die Bereiche der Münzen auf entsprechenden Ebenen der beiden Stapel (d.h., die Bereiche von Profilen von parallelen Abschnitten durchschneiden beide Münze-Stacks in gleichen Abständen von der den Boden) sind identisch. Schätzung der Mengen an Schweinen Organen und Geweben mit Cavalieri Prinzip^7,12,15 ist in Schritt 1.2 beschrieben.

Bestimmung des Ausmaßes der Gewebe Schrumpfung im Zusammenhang mit histologische Einbettung
In den Analysen über mehrere quantitative morphologischen Parametern gemessen in histologische Gewebeschnitte wirkt Einbettung bezogene Gewebe Schrumpfung während der Verarbeitung für Histologie Gewebe ermittelt und berücksichtigt werden. Das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen kann variabel sein und richtet sich sowohl auf das Gewebe, dessen Verarbeitung und Einbetten von mittleren^{8,13,17,18,19}. Im Allgemeinen auftreten Einbettung im Zusammenhang mit Änderungen des Volumens der eine Gewebeprobe (d. h.vor allem Schrumpfung) in allen drei Dimensionen von Raum und daher, wirkt sich auf alle Maßparameter durch quantitative stereologischen Analysen^{8 geschätzt} . Grundsätzlich kann das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen, ausgedrückt als die lineare Gewebe Schrumpfungsfaktor (f_S), geschätzt werden, wie in Schritt 1.3 gezeigt. und für die Korrektur (Schrumpf-Sensitive) quantitative morphologische Parameter¹⁴verwendet.

Volumengewichteten systematische Stichproben der Organe/Gewebe
Für die Einrichtung einer Biobank-Sammlung von porcinen Orgel/Gewebeproben erwiesen volumengewichteten systematische Stichproben Ansätze wie in Schritt 2 beschriebenen sich praktische, zeitsparende und effiziente Techniken für Generation des Vertreters, Mehrzweck-Gewebe Proben^7,8,9,15.

Generation von isotropen einheitliche zufälligen Abschnitten und vertikale einheitliche zufällige für quantitative stereologischen Analysen
Biobank Gewebeproben müssen für eine Vielzahl von verschiedenen stereologischen quantitative Analysemethoden für die Schätzung von maximal Parameter geeignet, die nicht ohne einen entsprechend vorbereiteten Probe ermittelt werden konnte. Fast alle quantitativen stereologischen Parameter können bestimmt werden, mit “isotrop (parteilos) einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte”^8,9. In IUR Abschnitten ist die dreidimensionale Ausrichtung der Schnittebene von der Gewebeprobe randomisiert. Kann dies durch Randomisierung der Position der Gewebeprobe relativ zur Position der Schnittebene, wie in der “Isector” Methode¹¹ (Protokoll Schritt 3.1) oder durch Randomisierung der Ausrichtung der Schnittebene bezogen auf die Gewebeprobe, wie in der “Orientator” Methode¹⁰ (Protokoll Schritt 3.2). In Gewebeproben, wie Haut oder Schleimhaut Exemplar zeigt eine natürlicherweise, oder definierte und einwandfrei identifizierbare vertikale Achse, Vorbereitung der “einheitlichen zufällige (VUR) Vertikalschnitten” (Protokoll Schritt 3.3.) streng geschnittene innerhalb der Ebene von ihren vertikale Achse ist vorteilhaft^8,20. Für eine vollständige Diskurs der die theoretischen Grundlagen der IUR/VUR Probenahme und eine umfassende Diskussion über nachgeschaltete quantitative stereologischen Potenzialanalysen wird der interessierte Leser zu den Lehrbüchern der quantitativen Stereologie im Leben bezeichnet. Wissenschaften^8,9.

Protocol

Alle beschriebene Methoden verwenden hier Gewebeproben von toten Tieren stammen und uneingeschränkt mit den deutschen gesetzlichen Bestimmungen des Tierschutzes. (1) Volumetrie Untertauchen Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/Organ (Abbildung 1 und Abbildung 2) 7 , 12 , 16<o…

Representative Results

Eintauchen-Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/organ Abbildung 12A -B zeigt die repräsentative Bestimmung der Dichte und Volumen einer porcinen Niere mit der Überflutung Technik im Schritt 1.1 (Abbildung 1, Abbildung 2) beschrieben. Repräsentative Ergebnisse der Dichtemessungen zusätzliche porcinen Organe und Gewebe s…

Discussion

Generation der Biobank Musterkollektionen von porcinen Tiermodellen erfordert robuste Techniken und Protokolle zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen, die reproduzierbare Generation des Vertreters, redundante Gewebeproben geeignet für ein breites Spektrum von verschiedenen Analysemethoden und Randomisierung der Ausrichtung der Probe Abschnitte für quantitative stereologischen Analysen. In diesem Artikel beschriebenen Methoden sind die Größen von porcinen Organen und Geweben angepasst und wurden entwickelt, um effekti…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.