אסטרטגיות דגימה ועיבוד של דגימות רקמה Biobank של מודלים ביו חזירי

Summary

היישום המעשי והביצועים של שיטות לדור של דגימות רקמה נציג של חזירי מודלים בבעלי חיים עבור קשת רחבה של ניתוחים במורד הזרם בפרויקטים biobank מודגמות, כולל volumetry, דגימה אקראית שיטתית, ועיבוד דיפרנציאלית של דגימות רקמה עבור סוגי ניתוחים כמותיים מורפולוגיות ומולקולרית.

Abstract

במחקר רפואי translational, מודלים חזירי בהתמדה הפך פופולרי יותר. בהתחשב בערך גבוה של חיות בודדות, במיוחד של חזיר מהונדס גנטית מודלים ומספר מוגבל לעיתים קרובות בעלי זמינות של מודלים אלה, הקמת (biobank) אוספים של דגימות רקמה שלמאחה מעובדים מתאים קשת רחבה של שיטות ניתוח עוקבות, כולל ניתוחים לא צוין בנקודת הזמן של הדגימה, מייצגים גישות משמעותי כדי לנצל את מלוא היתרונות של הערך translational של המודל. לגבי הייחוד של האנטומיה חזירי, הנחיות מקיף לאחרונה הוקמו לדור מתוקננת של נציג, באיכות גבוהה דגימות שונים חזירי איברים ורקמות. קווים מנחים אלה הם תנאים מוקדמים חיוניים עבור הפארמצבטית התוצאות, comparability שלהם בין מחקרים שונים החוקרים. ההקלטה של נתונים בסיסיים, כמו משקולות איברים כרכים, הקביעה של המיקומים דגימה, המספרים של דגימות רקמה שיווצר, כמו גם שלהם התמצאות, גודל, עיבוד וזמירה כיוונים, הם הגורמים הרלוונטיים קביעת את generalizability ואת השימושיות של הדגימה עבור מולקולרית, כמותיים המורפולוגיים. . הנה, המחשה, מעשית, צעד אחר צעד בהפגנה של הטכניקות החשובות בדור של נציג, רב תכליתי biobank דגימות רקמות חזירי מוצג. השיטות המתוארות כאן כוללים קביעת צפיפות, ואמצעי אחסון איברים/רקמות היישום של הליך משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית של איברים parenchymal על ידי ספירת נקודת, הנחישות של היקף רקמת הצטמקות הקשורים הטבעה היסטולוגית של דגימות, דור של דגימות מונחה באופן אקראי עבור ניתוחים כמותיים stereological, כגון איזוטרופיות אחיד אקראי (iur השוק) סעיפים שנוצר על ידי שיטות “Orientator” ו- “Isector”, המדים אנכי קטעים אקראיים (VUR).

Introduction

ב translational רפואה, חזירים הם נפוצים יותר ויותר לשימוש כמו חיה גדולה מודלים^1,2,3,4,5, עקב מספר קווי דמיון יתרון בין חזירי, אנטומיה, פיזיולוגיה, וזמינות של הוקמה שיטות ביולוגי מולקולרי לאפשר לדור של המותאמים, מהונדסים גנטית חזיר דגמים למגוון רחב של מחלות תנאים^1,4.

עם זאת, מספר החיות של מודל חזיר בהתאמה מסופקים עבור ניסויים בכל עת לעומת מודלים מכרסמים, מוגבל. זאת בשל המרווח דור חזירי של שנה אחת, ואת המאמצים פיננסיים וגוזלת זמן נדרש עבור הדור של חזירי מודלים טרנסגניים. לכן, חיות בודדות של מודל חזירי, כמו גם כדוגמאות ניתן להפיק של החזירים האלה הם חשובים מאוד, במיוחד אם מהונדסים גנטית מודלים חזירי ו/או בעיות ניסיוני לטווח ארוך (למשל, סיבוכים מאוחר של מחלות כרוניות) נבדקים ב אנשים בגילאי^2,6,7.

במהלך כל המחקר, הביצועים של ניתוחים נוספים אשר לא נקבעו בעיצוב ניסיוני הראשונית של המחקר עשוי מאוחר יותר להפוך להיות רלוונטי, למשל, לכתובת שאלות שונות הנובעות קודם לכן גילה ממצאים בלתי צפויות. אם הדוגמאות מתאימים עבור ניסויים נוספים אלה אינם זמינים, עלות גבוהה באופן לא פרופורציונלי והוצאות אינטנסיבית יתכן שיהיה צורך ליצור חזירים נוספים ודוגמאות רקמה. כדי להיות מוכנים לכל מצב כזה, דור של biobank אוספים דגימות שנשמרת גיבוי של איברים שונים, רקמות או ביו-נוזלים, באופן כמותי ובאופיו מתאימים למגוון רחב של ניתוחים שלאחר מכן, נחשב חשוב הגישה^2,6,7. הנובעות יתרונות מיטבית מודל בעלי חיים חזירי, הזמינות של דגימות biobank נאותה גם מציעה את האפשרות ייחודי כדי לבצע קשת רחבה של שיטות ניתוח שונות על מדגם זהה בחומרים על רמה איברים רב אותו חיות בודדות, למשל, על ידי חלוקת דוגמיות המדענים של קבוצות עבודה שונות מאורגן ב^6,72,רשת המחקר. בנוסף, אסטרטגיית הדגימה “מבט לעתיד” biobanking תורם גם הפחתה של מספר החיות הצורך במחקר. היתרונות של מודל חזירי biobanking הוכחו לאחרונה באיבר רב, multiomics רקחמ, איברים הצלב לדבר במודל של חזירי מהונדס גנטית של סוכרת לטווח ארוך, באמצעות דגימות מן Biobank החזיר מינכן MIDY ².

קיימות מספר דרישות חובה דגימות biobank חייב לעמוד בדרך כלל כדי לבסס את המהימנות ואת interpretability של תוצאות הבדיקות שבוצעו לאחר מכן. הדגימות להפיקם reproducibly, הם חייבים להיות נציג, כלומר, במידה מספקת שיקוף התכונות מעוניין מולקולרית מורפולוגיים של האיבר/הרקמות הדגימות נלקחו מ^-7. למתאים למגוון רחב של סוגי ניתוח במורד הזרם, הדגימות חייב להיות בכמויות מספיקות אשר מעובדות בהתאם לדרישות (כולל זמן ותנאי טמפרטורה) שיטות אנליטיות השונות, כולל תיאורי ניתוחים histopathological, כגון cryohistology, פרפין, היסטולוגיה פלסטיק, אימונוהיסטוכימיה, בחיי עיר הכלאה, ultrastructural אלקטרון מיקרוסקופיות ניתוחים ניתוחים אבחון קליני מעבדתי, כמו גם כמו מולקולרית ניתוחים של ה-DNA, RNA, חלבונים ו מטבוליטים.

כדי לאפשר ההערכה של מגוון רחב של פרמטרים מורפולוגי כמותיים ברורים כגון מספרים, אמצעי אחסון, אורכי או פני שטחים של רקמות שונות מבנים על ידי ניתוחים כמותיים stereological, קטע אקראי מטוסים של דוגמאות היסטולוגית של הרקמות/האיברים המתאימים צריכים להיות מוכנים^7,8,9,10,11. במחקרים כמותיים מורפולוגי, הקביעה מדויקת מהנפח הכולל של רקמה, איבר, או איבר תא, הדגימות שנלקחו ממנו (קרי, החלל הפניה) חשיבות מכרעת^{7,9 , 12} לחישוב הכמויות מוחלטת של הפרמטרים מעוניין בתוך האיברים המתאימים, רקמת, או אורגניזם. בסופו של דבר, ההשפעה של רקמות הטבעה הקשורות הצטמקות במהלך ההכנה של מקטעים היסטולוגית חייב להיות נחוש ונלקח לתוך חשבון¹³. לכן, ניתוחים כמותיים stereological, במיוחד של דגימות בארכיון (קבוע דגימות רקמה, רקמה מוטבע בלוקים, סעיפים היסטולוגית, וכו ‘) ממחקרים קודמים הם לפעמים מוגבלות מאוד או אפילו בלתי אפשרי¹², במיוחד אם volumetry של האיברים המתאימים/הרקמות לא בוצע, אם אין עיצובים דגימה נאותה הוחלו על צו מדגמים מייצגים, אם המספרים ואת כמויות של דוגמאות בודדות זמין אינן מספיקות, או העיבוד דוגמאות אינו תואם שערוך של הפרמטרים מורפולוגי כמותית של עניין. בשל הגורמים כמשפיע האפשריים סעפת, התאמת חומרי ארכיון-sample ניתוחים של פרמטרים מורפולוגי כמותיים ברורים באופן חד משמעי אין אפשרות לענות, אבל תלוי הערכה זהירה של כל מקרה ומקרה.

לפיכך, מיקום, גודל, מספר, עיבוד, כיוון זמירה, וכיוון דוגמאות של פוטנציאל ישפיעו על התוצאות של הבדיקות עוקבות, גורמים אלה חשיבות גדולה, יש לקחת בחשבון בעיצוב ניסיוני בכל מחקר. בכל הנוגע היבטים אלה תכונות מיוחדות של האנטומיה חזירי, הנחיות דיגום מקיף, מפורט, בקנה מידה גדול מותאם חזירי חייתיים לאחרונה הוקמו, מתן התייחסות איתנה מתוקננת, לשחזור , ויצירת יעיל של דגימות יתיר, מעובד כראוי, באיכות גבוהה יותר מ-50 שונים חזירי איברים ורקמות^6,7.

התיאורים מתודולוגי, את ערכת לימוד בנושא המוצג במאמר הנוכחי מספקים נתונים היסטוריים, המחשה, מובנת, צעד הוראות שלב אחר שלב מעשי בביצוע מגוון רחב של טכניקות volumetry, דגימה של רקמות חזירי, איברים, ועיבוד של דגימות רקמה עבור שיטות ניתוח שונות במורד הזרם. הטכניקות נבחרים כוללים שיטות לקביעת איברים/רקמות כרכים וצפיפות המבוססת על העקרונות של ארכימדס, קאבליירי⁹, לרבות קביעת מימדי תלת מימדי התכווצות של רקמות הקשורים הטבעה שונות ההטבעה מדיה¹⁴ במהלך עיבוד לבדיקה היסטולוגית, גישות יישום מעשית משוקלל נפח שיטתית אקראי הדיגום, עיבוד של דגימות רקמה שנדגמו עבור אחר העוקבים ניתוחים^7,8,9,15, דור של כראוי ומכוונים מעובד דגימות פוטנציאלית ניתוח כמותי stereological^{7,8, 9,10,11}. לצד היישום שלהם בפרויקטים biobank חזירי, השיטות והפגינו מתאימים בדרך כלל ללימודי כל בחינת מאפיינים כמותיים היסטו-מורפולוגי של איברים/רקמות. יתר על כן, דגימה אקראית שיטתית עיצובים הם מועיל במיוחד לדור של מדגמים מייצגים ניסויים בשיטות ניתוח מולקולרית כדי לזהות שינויים שפע של, למשל, RNAs, חלבונים או מטבוליטים ב איברים ורקמות שונות.

בפסקאות הבאות לספק הקדמה קצרה לשיטות אלו, בזמן הביצוע המעשי שלהם מתוארת בסעיף פרוטוקול.

הנחישות של איברים/רקמות כרכים
קביעה של איברים משקולות ואמצעי אחסון חשוב מספר הגדרות ניסיוני, כמו גורמים אלה עשוי להצביע על שינויים, שעשוי להיות קשור השפעול נבדק גורמי עניין. הנפח הכולל איברים/רקמה נדרש גם כדי לחשב פרמטרים כמותיים מוחלט, (למשל, המספר בתא סכום) של צפיפויות נפח מספריים מוערך stereologically (כלומר, מספר התאים ליחידת נפח של רקמה)^7,12. מלבד באמצעות ציוד טכני מורכב, כגון טומוגרפיה המחשב, טכניקות יש בעצם שלוש שיטות מעשיות נפוץ כדי לקבוע את נפח מוחלט של איבר או רקמה. היקף איבר יכול להיקבע על ידי “הנפחי מדידה ישירה”, לפי עקרון ארכימדס, קרי, מדידת הנפח של מים או תמיסת מלח שנעקרו על ידי המבנה כאשר לחלוטין. עם זאת, עבור איברים חזירי וזהובה גדולים, גישות אלה הם מעשי נוטה העוסקת, מכיוון שהם דורשים מבחנות גדולות מאוד נפח/מדידה. יותר נוח, ניתן לחשב את עוצמת הקול איברים/רקמה שלו משקל, צפיפות^7,12,16, אשר יכול ביעילות להיקבע באמצעות את “שיטת ועלייתו”^{7,12 ,16} (פרוטוקול שלב 1.1.). איברים/רקמות כרכים יכול גם להיות מוערך שימוש בגישות volumetry מבוסס על “עקרון Cavalieri” (1598-1647). במילים פשוטות, העיקרון קאבליירי קובע, כי אם שני עצמים הם למחלקה במישורים מקבילים למישור הקרקע, הפרופילים של הסעיפים לחתוך דרך שני העצמים ב המתאים המרחקים בין מישור הקרקע יש את אותם אזורים, שני העצמים יש באותו אמצעי אחסון. לפיכך, הנפח של אובייקטים באופן שרירותי בצורת יכול להיות מוערך כמו התוצר של אזורים הפרופיל שלהם סעיף סעיף מקביל, באותה מידה מרוחק מטוסים, המרחק בין המטוסים סעיף. . זה מובנת עם האנלוגיה הבאה: שקול שתי ערימות המורכב מספר זהה של מטבעות זהים ממוקמים לצד מחסנית אחת עם המשרת מטבעות בערימה אחד מעל השני מניב בצורת גליל של הערימה מטבע, והאחר ערימה של מטבעות עם מחוץ למרכז בעמדה מטבעות (איור 3 א). למרות הצורות של שני אוספים מטבעות שונים, האחסון שלהם זהים, מאז האזורים של המטבעות ברמות המתאימות של שתי ערימות (קרי, האזורים של פרופילים של מקטעים מקבילים לחתוך שתי ערימות מטבע מרחקים שווים קרקע) זהים. הערכה של הכרכים של חזירי איברים ורקמות באמצעות ה קאבליירי עקרון^7,12,15 מתואר בשלב 1.2.

קביעת היקף רקמת הצטמקות הקשורים הטבעה היסטולוגית
ניתוח של מספר פרמטרים כמותיים מורפולוגי נמדד בסעיפים רקמות היסטולוגית, כולל ההשפעה של רקמות הטבעה הקשורות הצטמקות המתרחשים במהלך עיבוד עבור היסטולוגיה רקמה להיות נחושים ולא נלקח בחשבון. היקף רקמת הטבעה הקשורות הצטמקות עשוי להיות משתנה, תלוי הן על הרקמה, העיבוד שלו את ההטבעה בינוני^{8,13,17,18,19}. באופן כללי, שינויים הקשורים הטמעה של אמצעי האחסון של דגימת רקמה (קרי, בעיקר הצטמקות) מתרחשים כל שלושת הממדים של החלל, ולכן משפיע על כל הפרמטרים ממדי ההערכה על ידי ניתוחים כמותיים stereological⁸ . בעיקרון, היקף רקמת הקשורות הטבעה, הביע כגורם הצטמקות לינארית רקמת (f_S), התכווצות יכול להיות מוערך כפי שמוצג צעד 1.3. משמשת עבור תיקון של פרמטרים מורפולוגי כמותית (הצטמקות רגיש)¹⁴.

משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית של איברים/רקמות
על הקמתה של אוסף biobank של דגימות איברים חזירי/רקמה, גישות משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית כמו שמתואר בשלב 2 הוכיחו להיות טכניקות מעשיות, לחיסכון בזמן ויעיל עבור הדור של נציג, רב תכליתי רקמות דוגם^7,8,9,15.

הדור של איזוטרופיות אחיד אקראי מקטעים ומקטעים אנכי אחיד אקראי עבור ניתוחים stereological כמותית
דגימות רקמה Biobank צריך להיות מתאים עבור מגוון רחב של שיטות ניתוח stereological כמותיים שונים עבור הערכה של הפרמטרים לא היתה אפשרות לקבוע בלי הדגימה מוכן כראוי, לכל היותר. כמעט כל הפרמטרים stereological כמותיים ניתן לקבוע, באמצעות “isotropic (עצמאית) אחיד אקראי (iur השוק) סעיפים”^8,9. בסעיפים iur השוק, כיוון תלת מימדי של המטוס סעיף של דגימת הרקמות הוא אקראי. אפשר להשיג על ידי אקראיות של העמדה של דגימת הרקמות ביחס המיקום של המטוס הסעיף, כפי שהוא מיושם בשיטה “Isector”¹¹ (פרוטוקול שלב 3.1), או על ידי אקראיות על הכיוון של המטוס סעיף שיחסית אליה דגימת הרקמות, כמו שיטת “Orientator”¹⁰ (פרוטוקול שלב 3.2). דגימות רקמה, כגון העור – או mucosa הדגימה הצגת נוכח באופן טבעי, או לזיהוי כראוי והמוגדרים ציר אנכי, הכנת “אחיד אקראי (VUR) מקטעים אנכיים” (פרוטוקול שלב 3.3.) אך ורק למחלקה בתוך מישור שלהם הציר האנכי הוא יתרון^8,20. על שיח שלם של היסודות התיאורטיים של הדגימה iur השוק/VUR, דיון מקיף של פוטנציאל במורד הזרם ניתוחים stereological כמותיים, הקורא מעוניין מכונה הלימוד של stereology כמותיים בחיים מדעי^8,9.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן להשתמש דגימות רקמה נגזר חיות מתות, מלא לציית לתקנות החוק הגרמני לרווחת בעלי חיים. 1. Volumetry ועלייתו בטכניקה לקביעת צפיפות רקמה/איברים (איור 1 , איור 2) 7 , 12 <s…

Representative Results

הטכניקה ועלייתו של קביעת צפיפות רקמה/איברים איור 12A -B מראה הקביעה נציג של צפיפות ונפח של כליה חזירי בטכניקה ועלייתו שמתואר בשלב 1.1 (איור 1, איור 2). נציג יותר תוצאות מדידות צפיפות של הא…

Discussion

הדור של אספנים מדגם biobank חזירי חייתיים דורש חזקים טכניקות ופרוטוקולים מצפני איברים/רקמות כרכים, הדור לשחזור של נציג, דגימות רקמה עודפת מתאים למגוון רחב של שיטות ניתוח שונות, ועבור אקראיות על הכיוון של מדגם מקטעים עבור ניתוחים כמותיים stereological. בשיטות המתוארות במאמר הנוכחי הם מותאמים הגדלים…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.