サンプリング戦略とブタの生物医学的モデルからバイオバンク組織サンプルの処理
Summary
バイオバンク プロジェクトの下流解析の広範なスペクトルのブタの動物モデルの代表的な組織サンプルの生成法の性能と実用を実証、超高速を含む体系的なランダム サンプリング定性・定量形態学上および分子分析型の組織サンプルの差分処理。
Abstract
医学トランスレーショナルリサーチのブタのモデルはより人気となって着実にいます。モデル、およびこれらのモデルの使用可能な動物の多くの場合限られた数の遺伝子組み換え豚を中心に、個々 の動物の高い値を考慮した、適切に処理された組織サンプル集 (バイオバンク) の確立に最適、以降の解析方法、サンプリングの時点で指定されていない解析などの広範なスペクトルを表すモデルの直線移動の値をフル活用する意味のあるアプローチ。ブタの解剖学の特性に関して包括的なガイドラインは標準化された世代代表、異なるブタの臓器や組織からの質の高いサンプルの最近確立されています。これらのガイドラインは、結果および比較可能性さまざまな研究と研究者間の再現性の重要な前提条件です。臓器重量とボリューム、生成される定量サンプリング場所および組織サンプルの番号と同様に自分の向き、サイズ、処理およびトリム方向などの基本的なデータの記録、関連する要因一般化と分子、定性的手法と定量的形態解析用の標本の有用性を決定します。ここでは、代表の世代の最も重要な技術の説明、実用的なステップバイ ステップ サンプル、ブタの組織から多目的バイオバンク検体が提示されます。ここで説明した方法があります決定臓器のボリュームと密度の実質臓器組織収縮の範囲のポイントを数える測定による出来高で加重された体系的なランダム サンプリング プロシージャのアプリケーションサンプル、および垂直な制服と”Orientator”と”Isector”メソッドが生成された等方性一様ランダム (フェース) セクションなど、定量的な薬剤分析ランダム配向試料の世代の組織学的埋め込みに関連ランダム (VUR) セクション。
Introduction
大動物モデル1,2,3,4、5、ブタの間いくつかの有利な類似のために医学の豚用ますます一般的なものと人体解剖学と生理学との生成を可能にする確立された分子生物的方法の可用性は、合わせて、豚モデル疾患条件1,4の広い範囲のための遺伝子組換え。
しかし、齧歯動物モデルと比較して、いつでも実験のため提供することができますそれぞれの豚のモデルの動物の数は限られています。これは約 1 年と世代の豚のモデルおよび動物飼育のために必要な金融と時間のかかる努力のブタの世代間隔が原因です。したがって、これらの豚から生成することができますサンプルと同様に、ブタのモデルの個々 の動物、遺伝子組み換え豚モデルおよび/または長期の実験問題 (例えば、晩期合併症の場合は特に、非常に貴重です高齢者2,6,7慢性疾患) について説明します。
後で関連性の高いことが判明して可能性がありますいない研究の初期の実験的設計で予定されていた追加解析のパフォーマンス任意の研究の過程で例えば、以前から生じる個別の質問を発見したアドレスに意外な発見。このような追加実験のための適切なサンプルが利用できない disproportionally 高いコストと時間のかかる支出は、追加の豚や組織サンプルを生成する必要あります。そのような事態に備えてするには、バイオバンクのさまざまな器官、組織、またはバイオ液体、量的そして質的幅広い以降の解析に適した保存バックアップ サンプル集の生成、重要と考えられる2,6,7に近づきます。ブタの動物モデルからの最適の利点を派生する、適切なバイオバンク サンプルの可用性で多臓器レベルで同一のサンプル素材にさまざまな分析方法の広範なスペクトルを実行する独自の可能性を提供しています、非常に同じ個々 の動物、例えば、さまざまなワーキング ・ グループの科学者にサンプルの分布によって組織された研究ネットワーク2,6,7。さらに、biobanking の「将来」のサンプリング戦略研究に必要な動物数削減にも貢献しています。ブタのモデル biobanking の利点は、最近多臓器、臓器を調べる multiomics 研究で実証されているミュンヘン MIDY 豚バイオバンクから試験片を使用して、長期的な糖尿病の遺伝子組み換えブタモデルにおけるクロストーク2。
実行後の分析の結果の解釈可能性と信頼性を確立する一般的に遵守しなければならないバイオバンク サンプルいくつかの必須要件があります。サンプルを再現性をもって発生する必要があります、彼らは十分に代表、すなわちをある必要があります7から採取した組織・臓器の興味の形態学的および分子機能を反映しています。下流解析のタイプの広い範囲に適していること、サンプルする必要があります十分な量での撮影、説明を含む様々 な分析方法の要求 (時間と温度条件を含む) に従って処理されます。cryohistology、パラフィン、プラスチック組織学、免疫組織化学の in situハイブリダイゼーション、微細構造の電子顕微鏡解析、臨床検査診断分析、同様に分子などの病理組織学的解析DNA、RNA、蛋白質、および代謝物の分析。
番号、ボリューム、長さ、表面積の異なる組織構造など個別の定量形態学的パラメーターの広い範囲の評価定量的薬剤分析できるように、ランダム化されたセクションの平面、それぞれの臓器・組織の組織サンプルは、7、8,9,10,11を準備する必要があります。(すなわち、空間参照) から撮影されたサンプルの定量形態学的研究、組織や臓器、器官のコンパートメントの合計量の精密測定は、決定的に重要な7,9,12それぞれの臓器、組織、または有機体内の興味がパラメーターの絶対的な数量を計算します。最終的には、組織切片の作製中に埋め込みに関連する組織収縮効果が決定しアカウント13に。したがって、定量的な薬剤試料の分析、特にアーカイブ (組織サンプル、埋め込まれたティッシュのブロック、標本等を固定) 前の調査から、時々 厳しく制限あるいは不可能12、します。数と利用可能な個々 のサンプルの量が十分な場合、代表的なサンプルを保証する十分なサンプリングのデザインが適用されていない場合、それぞれの臓器・組織の超高速を実行しなかった場合に特にまたは場合の処理、サンプルは、関心の定量形態学的パラメーターの推定と互換性がありません。マニホールドの可能な要因による個別の定量形態学的パラメーターの解析アーカイブ サンプル材料の適合性ははっきりと答えることができない、個々 のケースごとの慎重な評価によります。
したがって、場所、サイズ、数、処理、トリミング方向、およびサンプルの向きが可能性があります以降の解析の結果に影響を与える、これらの要因は非常に重要なは、任意の研究の実験の設計で考慮する必要があります。これらの側面およびブタの解剖学、ブタに適応の動物モデルが確立されている最近の包括的な, 詳細な, 大規模なサンプリング ガイドラインの特徴に関して標準化された、再現性のある堅牢な参照を提供します。、および 50 を超える異なるブタ臓器や組織6,7から冗長、適切に処理された、高品質のサンプルの効率的な生成。
方法論の説明と本稿で示すビデオ チュートリアルを提供様々 な超高速、技術の実用性能の手順詳細、説明でわかりやすくの手順でブタ組織のサンプリングと臓器と異なる下流解析のための組織サンプルの処理。関連組織の三次元収縮寸法の測定を含む注目のテクニックは臓器のボリュームとアルキメデスとカヴァリエーリの9の原則に基づいて密度の定量方法など、病理検査の処理中に別の埋め込みメディア14に埋め込み、実用的な出来高で加重された体系的なランダム サンプリングのアプリケーションに近づくと、サンプリングされた組織検体の処理別以降分析7,8,9,15と世代の適切な指向し、潜在的な薬剤の定量的解析7、8のサンプルを処理 9,10,11。ブタ バイオバンクのプロジェクトで彼らのアプリケーションの横に示されたメソッドは、一般的にすべての臓器・組織の病理組織形態の定量的なプロパティを調べることの研究の適切です。さらに、体系的なランダム サンプリングのデザインが世代の豊富な変化、例えばRna、蛋白質、または代謝産物を検出する分子の解析手法を用いた実験の代表的なサンプルのため特に有益ですさまざまな臓器や組織。
次の段落は、その実用性能がプロトコル」に記載されている間にこれらのメソッドを簡単に紹介を提供します。
臓器ボリュームの定量
器官の重量とボリュームの決定は、いくつかの実験的設定の重要な可能性がありますこれらの要因として実験的に関連する可能性のある変更を調べた関心の要因臓器・組織の総量もよく絶対定量的なパラメーター (例えば、総セル数)、stereologically 推定数値ボリューム密度 (すなわち、ボリューム単位セルの数からの計算に必要な組織) の7,12。コンピューター断層撮影などの複雑な技術的な装置を使用してのテクニックとは別に基本的に器官またはティッシュの絶対量を決定するために一般的に使用される 3 つの実用的な方法があります。器官のボリュームは、「直接体積測定」すなわち、アルキメデスの原理によると、水または完全に浸漬した場合の構造によって転置された生理食塩水の量を測定して決定できます。ただし、対等に大きいブタ器官のこれらのアプローチは非現実的であり、不正確さをしやすい非常に大きい容積測定フラスコを要求するので。便利に、臓器・組織のボリュームはその密度と重量7,12,16、「水没法」7,12 を使用して効率的に判断できます。 から計算できます ,16 (プロトコル手順 1.1)。(1598-1647)「カバリエリの原理」に基づく超高速アプローチを使用しても、臓器・組織ボリュームを推定できます。簡単に言えば、カヴァリエリの原理の状態、地面に平行平面の区分である 2 つのオブジェクトと対応するで 2 つのオブジェクトをセクションのプロファイルをカットする場合、地面からの距離で 2 つのオブジェクト、同じエリアがあります。同じボリュームを持っています。したがって、並列、等しく遠く離れている断面平面と断面平面間の距離で、プロファイル断面の製品として任意形状オブジェクトのボリュームを推定できます。これは次の類推で理解できる: 同じ硬貨の同じ数から成る 2 つのスタックは、サイドバイ サイド、コイン整然としたコイン スタック等の円筒形の降伏、互いの上に積み上げ、1 つのスタックの配置検討します。オフセンターの硬貨のスタックには、コイン (図 3 a) が配置されます。両方のコイン スタックの形状が異なる、ボリュームが同じで、両方のスタックの対応するレベルでコインの区域以来 (すなわち、並列セクションのプロフィールの部分はから同じ距離で両方のコイン スタックを介してカット、地面) と同じです。ブタの臓器や組織は、カヴァリエリの原理7,12,15を使用してのボリュームの推定、1.2 の手順で説明します。
組織学的埋め込みに関連する組織の収縮の程度の決定
組織切片で測定するいくつかの定量的形態学的パラメーターの解析では、ティッシュの組織学のための処理中に発生した埋め込みに関連する組織収縮効果決定し、考慮しています。埋め込みに関連する組織の収縮の範囲変数、組織、その処理と埋め込み中8,13,17,18,19に依存します。一般的に、埋め込み関連組織サンプル (すなわち、ほとんど収縮) の容積の変化領域、および、したがって、すべての 3次元パラメーター推定定量化薬剤分析8 に影響を与えるすべての 3 つの次元で.基本的には、手順 1.3 に示すように埋め込みに関連する組織の収縮は、線形組織収縮因子 (fS) として表現の程度を推定できます。(収縮に敏感な) 定量的形態パラメーター14の補正のために使用されます。
出来高で加重された臓器・組織の体系的なランダム サンプリング
ブタ臓器試料のバイオバンク コレクションの構築、手順 2 で説明したように出来高で加重された体系的なランダム サンプリングの手法が代表者の世代の実用的な時間の節約と効率的なテクニックをあることを証明します。多目的組織サンプル7,8,9,15です。
薬剤の定量解析の等方性均一ランダム セクションおよび均一ランダム垂直セクションの生成
バイオバンク組織サンプルは、適切に準備された標本なしできなかったパラメーターの最大値の推定のための異なる定量的解析方法の広い範囲に適している必要があります。「等方性 (独立) 均一ランダム (フェース) セクション「8,9を使用して、ほぼすべての定量的な主パラメーターを決定できます。フェース セクションで組織サンプルの断面平面の 3次元配向がランダムします。これは、断面平面の位置を基準にして組織サンプルの位置のランダム化が適用されると”Isector”法11 (プロトコル手順 3.1)、相対的な断面平面の方向のランダム化に実現、組織サンプルは、”Orientator”法10 (プロトコル手順 3.2) のように。皮膚または粘膜標本自然存在または定義され適切に識別垂直軸、「垂直一様ランダム (VUR) セクション」の準備を表示するなどの組織サンプルの (プロトコル手順 3.3) は厳密の平面内断面の縦軸は有利な8,20です。フェース/VUR サンプリングの理論的基礎と潜在的な下流定量化薬剤分析の包括的な議論の完全な談話、興味を持った読者定量的ステレオロジー人生の教科書に呼びます科学8,9。
Protocol
Representative Results
Discussion
ブタの動物モデルからのバイオバンク サンプル コレクションの生成臓器ボリュームによる冗長な組織サンプルの広い範囲に適しています代表者の再現可能な世代堅牢な技術とプロトコルが必要です。異なる分析方法と薬剤の定量分析のためのサンプル セクションの方向のランダム化のため。本稿で説明する方法は、ブタの臓器や組織のサイズに合わせられるし、これら要求2</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はリサの都市の優秀な技術的な支援をありがちましょう。
Materials
| Agar | Carl Roth GmbH, Germany | Agar (powder), Cat.: 5210.3 | Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves. |
| Caliper | Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany | Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 | Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well. |
| Casting molds (metal) | Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany | Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b | Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well. |
| Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) | n.a. | n.a. | Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al. Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016) |
| Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles | n.a. | n.a. | Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013). |
| Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) | Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China | Y10006 and Y10005 | Any other type of standard office foldback clamps will do as well. |
| Forceps (anatomical) | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 | Any type of anatomical forceps will do. |
| Formaldehyde-solution 4% | SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany | Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 | Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves. |
| Graph paper (for calibration) | Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de | Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 | Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do. |
| Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 | Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do. |
| Laboratory scale(s) | Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany | PM6000 | Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do |
| Sartorius AG, Göttingen, Germany | BP61S | ||
| Microtome blades | Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany | FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 | Any kind of single-use microtome blades will do. |
| Morphometry/planimetry software/system | National Institute of Health (NIH) | ImageJ | Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997). |
| Zeiss-Kontron, Eching, Germany | VideoplanTM image analysis system | Out of stock | |
| Photo camera | Nikon | D40 | Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod will do. |
| Plastic transparencies | Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany | Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.: 3562 | Any (laser)-printable plastic transparency will do. |
| Random number tables | n.a. | n.a. | Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/ |
| Razor blades | Plano GmbH, Wetzlar, Germany | T5016 | Any kind of razor blades will do. |
| Ruler | Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de | Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 | Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well. |
| Saline (0.9%) | Carl Roth GmbH, Germany | Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 | To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C. |
| Scalpel blades | Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany | BRAUN Surgical blades N°22 | Any kind of scalpel blades will do. |
| Scanner | Hewlett-Packard | hp scanjet 7400c | Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do. |
| Slicing devices | n.a. | n.a. | Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al. Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016). |
| Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) | Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany | Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm | Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections) |
| Thin wire | Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de | Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 | Any other kind of thin wire will also do. |
| Tissue paper | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 | Any other kind of laboratory tissue paper will do as well. |
| Waterproof pen | Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany | Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 | Any other kind of waterproof pen will do as well. |
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