Strategier för provtagning och behandling av Biobank vävnadsprover från svin biomedicinska modeller

Summary

Den praktiska tillämpningen och prestanda för metoder för generering av representativa vävnadsprover på svin djurmodeller för ett brett spektrum av nedströms analyser i biobank projekt demonstreras, inklusive volumetry, systematisk slumpmässig provtagning, och differentierad behandling av vävnadsprover för kvalitativa och kvantitativa morfologiska och molekylära analyser typer.

Abstract

I translationell medicinsk forskning, har svin modeller stadigt blivit mer populära. Med tanke på det höga värdet på enskilda djur, särskilt av genmodifierad gris modeller och ofta begränsas av antalet tillgängliga djur av dessa modeller, inrättandet av (biobank) samlingar av tillräckligt bearbetade vävnadsprover passar en brett spektrum av efterföljande analyser metoder, inklusive analyser inte anges vid tidpunkten för provtagning, utgör meningsfulla strategier för att dra full nytta av överbryggande värdet av modellen. Om Europeiska skoindustrins särdrag av svin anatomi, har omfattande riktlinjer nyligen fastställts för standardiserade generation av företrädare, högkvalitativa prover från olika svin organ och vävnader. Dessa riktlinjer är väsentliga förutsättningar för reproducerbarheten för resultaten och deras jämförbarhet mellan olika studier och utredare. Registrering av grundläggande uppgifter, såsom organvikter och volymer, vid fastställandet av mätplatser som numrerar av vävnadsprover ska genereras, samt deras orientering, storlek, bearbetning och trimning riktningar, är relevanta faktorer fastställande av generaliserbarhet och användbarhet av förlagan för molekylär, kvalitativa och kvantitativa morfologiska analyser. Här, en belysande, praktiska, stegvisa demonstration av de viktigaste teknikerna för generering av representant, multi-purpose biobank provbit från svin vävnader presenteras. Metoderna som beskrivs här inkludera bestämning av organ/vävnad volymer och densiteter, tillämpningen av ett volymvägda systematisk slumpmässig provtagningsförfarande för parenkymal organ genom punkt-räkna, bestämning av omfattningen av vävnad krympning relaterade till histologiska inbäddning av prover, och generering av slumpmässigt orienterade prover för kvantitativa beteendetester analyser, till exempel isotropa enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt genereras av metoderna ”Orientator” och ”Isector”, och vertikala uniform slumpmässig (VUR) sektioner.

Introduction

I translationell medicin, grisar är vanligare för användning som stort djur modeller^1,2,3,4,5, flera fördelaktiga likheter mellan de svin och människans anatomi och fysiologi, och tillgängligheten av etablerade molekylär biologiska metoder som möjliggör generering av skräddarsydda, genetiskt modifierade gris modeller för ett brett utbud av sjukdom villkor^1,4.

Jämfört med gnagare modeller, är antalet djur av en respektive gris modell som kan tillhandahållas för experiment när som helst dock begränsad. Detta beror på svin generation intervallet för ungefär ett år och de finansiella och tidskrävande insatser som krävs för generering av svin modeller och djurhållning. Enskilda djur av en svin modell, liksom de prover som kan genereras från dessa grisar, är därför mycket värdefullt, särskilt om genetiskt modifierade svin modeller och/eller långsiktiga experimentella problem (t.ex., det sena komplikationer av kroniska sjukdomar) undersöks i äldre individer^2,6,7.

Under loppet av någon studie, prestanda av ytterligare analyser som inte hade planerats i den ursprungliga experimentella designen av studien skulle senare visa sig vara relevanta, t.ex., till adress skilda frågor som uppkommer tidigare upptäckt oväntade fynd. Om det inte finns lämpliga prover för sådana ytterligare experiment kan oproportionerligt höga kostnader och tidskrävande utgifter vara nödvändigt att generera ytterligare grisar och vävnadsprover. För att vara förberedd för sådana eventualiteter, anses generation av biobank samlingar av bevarade säkerhetskopiera prover av olika organ, vävnader eller bio-vätskor, kvantitativt och kvalitativt lämplig för ett brett spektrum av efterföljande analyser, en viktig strategi^2,6,7. Som följer optimala fördelar ett porcint djurmodell, tillgången på lämpliga biobanksprov erbjuder också den unika möjligheten att utföra ett brett spektrum av olika analysmetoder på identiskt provmaterial på mång–organ nivå i den mycket samma enskilda djur, t.ex., av distribution av prover till forskare av olika arbetsgrupper som organiseras i en forskning nätverk^2,6,7. Dessutom bidrar den ” framåtblickande ” provtagningsstrategi inom biobanker också till en minskning av antalet djur som behövs i en studie. Fördelarna med svin modell biobanker har nyligen visats i en flera organ, multiomics studie, att undersöka organ cross talk i en genetiskt modifierade svin modell av långvarig diabetes mellitus, med prover från München MIDY Gris biobanken ².

Det finns vissa obligatoriska krav biobanksprov måste i allmänhet följa för att fastställa tillförlitlighet och tolkningsbarhet av resultaten av de senare utförda analyserna. Proverna måste genereras reproducibly, och de måste vara representant, dvstillräckligt återspeglar de berörda morfologiska och molekylära funktionerna av vävnad/organ proven togs från⁷. För att vara lämplig för ett brett utbud av nedströms analystyper, måste proverna tas i tillräckliga mängder och behandlas enligt de olika analysmetoder, inklusive beskrivande krav (inklusive tid och temperatur förhållanden) histopatologiska analyser, såsom cryohistology, paraffin och plast histologi, immunohistokemi, i situ hybridisering, ultrastrukturella elektron mikroskopisk analyser och kliniska diagnostiska laboratorieanalyser, samt som molekylär analyser av DNA, RNA, proteiner och metaboliter.

För att möjliggöra bedömning av en rad distinkta kvantitativa morfologiska parametrar såsom tal, volymer, längder eller ytor av distinkta vävnad strukturer av kvantitativa beteendetester analyser är randomiserade avsnitt flygplan av den histologiska prover av respektive organ/vävnader behöver förberedas^7,8,9,10,11. I kvantitativa morfologiska studier, exakt bestämning av den totala volymen av vävnad, organ eller organ fack, proven togs från (dvs.utrymmet som referens) är ytterst viktig^{7,9 , 12} för att beräkna de absoluta kvantiteterna av de berörda parametrarna inom respektive organ, vävnad eller organism. Effekten av inbäddning-relaterade vävnad krympning under upprättandet av histologiska avsnitt har småningom, bestämmas och tas in i konto¹³. Kvantitativa beteendetester analyser, särskilt av arkiverade prover (fast vävnadsprover, inbäddade vävnad block, histologiska sektioner, etc.) från tidigare studier är därför ibland starkt begränsad eller omöjligt¹², särskilt om volumetry i respektive organ/vävnader inte utfördes, om ingen adekvat provtagning mönster tillämpades för att motivera representativa prover, om de siffror och mängder av tillgängliga enskilda prover är otillräckliga eller om behandlingen av den prover är oförenligt med uppskattning av den kvantitativa morfologiska parametrar av intresse. På grund av de många möjliga påverkande faktorerna, lämpligheten av Arkiv-provmaterial för analyser av olika kvantitativa morfologiska parametrar kan inte entydigt besvaras, men beror på en noggrann bedömning av varje enskilt fall.

Således, eftersom plats, storlek, antal, bearbetning, trimning riktning och orientering av prover potentiellt påverkar resultaten av de efterföljande analyserna, dessa faktorer är av stor betydelse och måste beaktas i experimentell design av någon studie. När det gäller dessa aspekter och särdragen hos svin anatomi, omfattande, detaljerad, storskalig provtagning riktlinjer anpassas till svin djurmodeller har nyligen fastställts, som ger en robust hänvisning till standardiserade och reproducerbar , och effektiv generering av redundant, tillräckligt bearbetade, högkvalitativa prover från mer än 50 olika svin organ och vävnader^6,7.

De metodiska beskrivningarna och den video tutorial som visas i denna artikel ger detaljerad, belysande, begriplig, steg-för-steg-instruktioner för praktiska utförandet av en mängd olika tekniker för volumetry, provtagning av svin vävnader och organ, och bearbetning av vävnadsprover för olika nedströms analysmetoder. De utvalda teknikerna inkluderar metoder för bestämning av organ/vävnad volymer och densiteter baserat på principerna om Archimedes och Cavalieri⁹, inklusive fastställande av dimensionerar av tredimensionella krympning av vävnad relaterade till den inbäddning i olika bädda media¹⁴ under bearbetning för Histologisk undersökning, tillämpningen av genomförbara volymvägda systematisk slumpmässig provtagning metoder, behandling av samplade vävnadsprover för olika efterföljande analyser^7,8,9,15, och generation av korrekt orienterade och bearbetade prover för potentiella kvantitativa beteendetester analyser^{7,8, 9,10,11}. Bredvid deras tillämpning i svin biobank projekt är påvisade metoderna i allmänhet lämpligt för alla studier kvantitativa histo-morfologiska egenskaper av organ/vävnader. Dessutom är systematisk slumpmässig provtagning mönster särskilt fördelaktigt för generering av representativa prover i experiment med molekylära analysmetoder för att upptäcka överflöd förändringar av, t.ex., RNAs, proteiner eller metaboliter i olika organ och vävnader.

Nästa punkter ger en kort introduktion till dessa metoder, medan deras praktiska resultat beskrivs i avsnittet protokoll.

Bestämning av organ/vävnad volymer
Bestämning av organvikter och volymer är viktigt i flera experimentella inställningar, eftersom dessa faktorer kan indikera förändringar, potentiellt relaterade till experimentellt undersökte faktorer av intresse. Den totala volymen av en organ/vävnad krävs också ofta att beräkna absoluta kvantitativa parametrar (t.ex., den totala mobilnummer), från stereologically beräknade numeriska volym tätheter (dvs, det antalet celler per volymenhet av vävnad)^7,12. Förutom teknik använder komplexa tekniska utrustning, såsom datortomografi, det finns i princip tre praktiska metoder som vanligen används för att bestämma den absoluta volymen av ett organ eller vävnad. Volymen av en orgel kan bestämmas genom ”direkt volumetrisk mätning” enligt principen om Archimedes, dvs, volymmätning av vatten eller koksaltlösning som fördrivits av strukturen när helt nedsänkt. För comparably stora svin organ är dessa metoder dock opraktisk och benägna att vagheten, eftersom de kräver mycket stor volymetrisk/mäta kolvar. Mer bekvämt, volymen av en organ/vävnad kan beräknas från dess vikt och densitet^7,12,16, som effektivt kan bestämmas med hjälp av den ”nedsänkning metod”^{7,12 ,16} (protokoll steg 1.1.). Organ/vävnad volymer kan också uppskattas med volumetry metoder som bygger på ”principen om Cavalieri” (1598 – 1647). I enkla termer, Cavalieri principen anges, att om två objekt är sektioneras på plan som är parallellt med ett jordplan och profiler av avsnitten skär genom de två objekten på motsvarande avstånd från jordplanet har samma områden, två objekt har samma volym. Volymen av godtyckligt formade objekt kan således beräknas som produkten av deras avsnitt profilområden i parallella, lika avlägsen avsnitt flygplan och avståndet mellan de avsnitt plan. Detta är begripligt med följande liknelse: överväga två högar bestående av samma antal identiskt mynt placeras sida vid sida, en stack med den mynt ordnad staplade ovanpå varandra ger en cylindrisk form av mynt stacken och andra stack av mynt med off-center placerad mynt (figur 3A). Även om båda mynt stackar former är olika, deras volymer är samma, sedan områdena av mynten på motsvarande nivåer i båda stackar (dvs.områdena av profiler av parallella sektioner skär genom båda mynt stackar på lika avstånd från den marken) är identiska. Uppskattning av volymerna av svin organ och vävnader med hjälp av Cavalieri princip^7,12,15 beskrivs i steg 1.2.

Fastställande av omfattningen av vävnad krympning relaterade till histologiska inbäddning
I analyser av flera kvantitativa morfologiska parametrar mäts i histologiska vävnadssnitt, har effekten av inbäddning-relaterade vävnad krympning som inträffar under vävnad behandling för histologi skall fastställas och beaktas. Omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning kan vara variabel, och beror både på vävnaden, dess bearbetning och inbäddning medium^{8,13,17,18,19}. Allmänhet, inbäddning-relaterade förändringar av volymen av ett vävnadsprov (dvsmestadels krympning) förekommer i alla tre dimensioner av rymden, och därmed påverkar alla dimensionell parametrar beräknad av kvantitativa beteendetester analyser⁸ . I princip kan omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning, uttryckt som en Linjär krympning vävnadsfaktor (f_S), uppskattas som visas i steg 1.3. och används för korrigering av (krympning-känslig) kvantitativa morfologiska parametrar¹⁴.

Volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av organ/vävnader
För etableringen av en biobank samling av svin orgel/vävnadsprover, har volymviktade systematisk slumpmässig provtagning metoder såsom beskrivs i steg 2 visat sig vara praktiska, tidsbesparande och effektiva tekniker för generering av ombud, Multi-Purpose vävnad prover^7,8,9,15.

Generation av isotropiskt enhetliga Random avsnitt och vertikala enhetliga Random avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser
Biobank vävnadsprover måste vara lämplig för ett brett utbud av olika kvantitativa beteendetester analysmetoder för uppskattning av högst parametrar som inte kunde fastställas utan en lämplig förlaga. Nästan alla kvantitativa beteendetester parametrar kan bestämmas med hjälp av ”isotropiskt (oberoende) enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt”^8,9. I IUR avsnitt, är avsnittsplanet av vävnadsprov tredimensionella orientering randomiserade. Detta kan uppnås genom randomisering av placera av vävnadsprov i förhållande till placeringen av avsnittsplanet, som tillämpas i ”Isector” metod¹¹ (protokoll steg 3.1) eller genom randomisering av orienteringen av avsnittsplanet förhållande till den vävnadsprov, liksom de ”Orientator” metod¹⁰ (protokoll steg 3,2). I vävnadsprover, som hud- eller slemhinna specimen visar en naturligt, eller definierade och korrekt identifierbar vertikal axel, upprättandet av ”vertikala enhetliga slumpmässiga (VUR) avsnitt” (protokoll steg 3.3.) strikt sektioneras inom planet för deras lodräta axeln är fördelaktiga^8,20. För en komplett diskurs de teoretiska grunderna i IUR/VUR provtagning och en omfattande diskussion om potentiella nedströms kvantitativa beteendetester analyser hänvisas intresserade till läroböcker av kvantitativa stereology i livet vetenskaper^8,9.

Protocol

Alla metoder som beskrivs använder här vävnadsprover från döda djur och följa helt den tyska lagliga reglementet av djurskydd. 1. Volumetry Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/Organ tätheter (figur 1 och figur 2) 7 , 12 , 16 Förbereda material: skalpell…

Representative Results

Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/organ densitet Figur 12A -B visar representativa bestämning av densiteten och volymen av en svin njure med nedsänkning tekniken som beskrivs i steg 1,1 (figur 1, figur 2). Mer representativa resultat densitet mätningar av ytterligare svin organ och vävnader presenteras i <str…

Discussion

Generering av biobank provkollektioner från svin djurmodeller kräver robusta tekniker och protokoll för bestämning av organ/vävnad volymer, reproducerbara generering av representant, redundanta vävnadsprover som är lämplig för ett brett spektrum av olika analysmetoder, och för randomisering av orienteringen av provet avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser. De metoder som beskrivs i denna artikel är anpassade efter storleken på svin organ och vävnader, och har utvecklats för att effektivt möta de…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.