Örnekleme stratejileri ve Biobank doku örnekleri domuz Biyomedikal modellerinden işlenmesi

Summary

Pratik uygulaması ve yöntemleri performansını aşağı akım analizleri biobank projeleri geniş bir yelpazede için domuz hayvan modellerin temsilcisi doku örnekleri oluşturmada, volumetry, dahil olmak üzere içinde gösterilen sistematik rastgele örnekleme, ve doku örnekleri nitel ve nicel morfolojik ve moleküler analiz türleri için farklı işleme.

Abstract

Translasyonel tıbbi araştırma, domuz modelleri giderek daha popüler hale gelmiştir. Bireysel hayvanların, özellikle genetiği değiştirilmiş domuz yüksek değer modelleri ve bu modellerin mevcut hayvanların genellikle sınırlı sayıda göz önüne alındığında, yeterince işlenmiş doku örnekleri (biobank) koleksiyonları kurulması için uygun bir Sonraki analizleri yöntemleri, örnekleme, zaman noktada belirtilmemiş analizleri de dahil olmak üzere geniş yelpazede translasyonel değer modelinin tam yararlanmak için anlamlı yaklaşımlar temsil eder. Domuz anatomisi özellikleri ile ilgili kuralların son temsilcisi, yüksek kaliteli örneklerinden farklı domuz organ ve dokulara standart üretimi için kurulmuştur. Bu kurallar sonuçları ve onların karşılaştırılabilir farklı çalışmalar ve Müfettişler arasında tekrarlanabilirlik için gerekli önkoşullar vardır. Organ ağırlıkları ve birimleri, oluşturulacak, belirlenmesi örnekleme yerlerin ve doku örnekleri sayıların yanı sıra yönlendirme, boyutu, işleme ve düzeltme yönergeleri, gibi temel veri kaydı ilgili faktörlerdir generalizability ve moleküler, nitel ve nicel morfolojik analiz için numune kullanılabilirliği belirleniyor. Burada, en önemli teknikler bir açıklayıcı, pratik, adım adım gösteri kuşak temsilcisi için domuz dokular çok amaçlı biobank örneği sunulmaktadır. Burada açıklanan yöntemleri belirlenmesi organ/doku birimleri ve yoğunlukları, parenkimal organları tarafından noktası-sayma, doku büzülme ölçüde belirlenmesi için bir sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı yordam uygulama içerir Histolojik örnekleri ve rastgele odaklı örnekleri nesil izotropik uniform rasgele (diploması) bölümleri “Orientator” ve “Isector” yöntemleri ve dikey üniforma tarafından üretilen gibi nicel stereological analizleri için gömme için ilgili rasgele (VUR) bölümleri.

Introduction

^1,2,3,4,5, domuz arasında birkaç avantajlı benzerlikler nedeniyle büyük hayvan modelleri gibi translasyonel tıpta, domuz kullanım için giderek daha yaygın ve insan anatomisi ve fizyolojisi ve kurulan moleküler biyolojik yöntemler nesil için izin durumu özel olarak tasarlanmış, domuz modelleri çok çeşitli hastalık koşulları^1,4için genetik olarak değiştirilmiş.

Ancak, kemirgen modellerle karşılaştırıldığında, deneyler için herhangi bir zamanda sağlanan ilgili domuz manken hayvanların sayısı sınırlıdır. Bu domuz üretimi aralığı yaklaşık bir yıl ve domuz modelleri ve Hayvancılık üretimi için gerekli mali ve zaman yoğun çabaları kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, bir domuz modeli yanı sıra bu domuzların oluşturulan örnekleri bireysel hayvanlar özellikle genetiği değiştirilmiş domuz modelleri ve/veya uzun vadeli deneysel sorunları (örneğin, geç komplikasyonlar çok değerli Kronik hastalıklar) yaşlı bireylerin^2,6,7‘ incelenir.

Herhangi bir çalışma sırasında çalışma ilk deneysel tasarım zamanlanan değil ek Değerlendirmeler performansını daha sonra ilgili, olup çıkmak örneğin, farklı sorular daha önce doğan keşfetti adresine beklenmeyen bulgular. Böyle ek deneyleri için uygun örnekleri mevcut değilse, orantısız yüksek maliyet ve zaman yoğun harcamaları ek domuz ve doku örneği oluşturmak gerekli olabilir. Bu tür olasılıklar için hazırlıklı olmak, korunmuş yedekleme örnekleri farklı organ, doku veya biyo-sıvılar, nicelik ve nitelik uygun sonraki analizleri, geniş bir yelpazesi için biobank koleksiyon üretimi önemli bir kabul edilir ^2,6,7yaklaşım. En iyi faydaları bir domuz hayvan modelden türeterek, yeterli biobank örnekleri kullanılabilirliğini de aynı örnek malzemeler bir çok organ düzeyi farklı analiz yöntemleri geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için benzersiz imkanı sunuyor çok aynı bireysel hayvanlar, örneğin, dağıtım örnekleri için farklı çalışma gruplarının bilim adamları tarafından bir araştırma ağ^2,6,7‘ düzenledi. Ayrıca, biobanking ” ileri ” örnekleme stratejisinde de hayvanların bir çalışmada gerekli sayıda bir azalma katkıda bulunur. Domuz modeli biobanking avantajları son zamanlarda bir çok organ, multiomics çalışma, organ inceleyerek gösterilmiştir çapraz konuşma Münih Geçireceğimi domuz Biobank üzerinden örnekler kullanarak uzun vadeli diyabet, genetiği değiştirilmiş bir domuz modeli ².

Biobank örnekleri genel olarak güvenilirlik ve daha sonra gerçekleştirilen analizleri sonuçlarının interpretability kurmak için uymanız gerekir bazı zorunlu gereksinimleri bulunmaktadır. Örnekleri tekrarlanarak üretilen gerekir ve temsilcisi, Yani, yeterince olmaları gerekir doku/organ örnekleri⁷den alınmıştır baktılar morfolojik ve moleküler özelliklerini yansıtan. Aşağı akım analiz türleri geniş bir yelpazesi için uygun olmak, örnekleri gerekir yeterli miktarlarda alınır ve (zaman ve sıcaklık şartları da dahil olmak üzere) taleplerini açıklayıcı dahil olmak üzere farklı analitik yöntemleri göre işlenen cryohistology, parafin ve plastik Histoloji, immünhistokimya, in situ hibridizasyon, ultrastructural elektron Mikroskopik analizler ve klinik laboratuvar tanı analizleri, de moleküler gibi histopatolojik analizleri DNA, RNA, proteinler ve metabolitleri analizleri.

Randomize bölüm numaraları, birimler, uzunlukları veya farklı doku yapılarının yüzey alanları gibi farklı nicel morfolojik parametrelerin geniş değerlendirilmesi için nicel stereological analizleri tarafından izin vermek için uçak Histolojik örnekleri ilgili organ/dokuların^7,8,9,10,11hazırlıklı olması gerekiyor. Nicel morfolojik çalışmalarda, doku, organ veya organ yuvası, Toplam hacim kesin olarak belirlenmesi (Yani, başvuru alanı) örnekleri alınmıştır en önemlisi önemli^7,9 ‘ dur ^, baktılar parametreleri ilgili organ, doku veya organizma içinde mutlak miktarlarını hesaplamak için ¹² . Sonunda, belirlenecek ve hesap¹³alınan gömme ile ilgili doku büzülme histolojik kesitler hazırlanması sırasında etkisi vardır. Bu nedenle, nicel stereological, özellikle önceki çalışmalar arşivlenmiş örnekleri (Sabit doku örnekleri, katıştırılmış doku blokları, histolojik kesitler, vb) bazen ciddi sınırlı veya hatta imkansız¹²analizlerdir, Hayır yeterli örnekleme tasarımları numaraları ve mevcut bireysel örnekleri miktarda yetersiz ise temsilcisi örnekleri, emri için uygulandıysa özellikle volumetry ilgili organ/dokuların, gerçekleştirilmedi veya varsa işlenmesi örnekleri, ilgi nicel morfolojik parametre tahmini ile uyumlu değil. Manifold mümkün etkileyen faktörler nedeniyle ayrı nicel morfolojik parametrelerinin analizler için arşiv-örnek malzemelerin uygunluğu tümden yanıtlanamaz, ancak tek tek her durum dikkatli değerlendirilmesi bağlıdır.

Böylece, konum, boyut, sayısı, işleme, süsleme yön ve örnekleri yönünü potansiyel olarak sonraki analizleri sonuçlarını etkileyecek gibi bu faktörlerin büyük önem taşıyan şeyler ve herhangi bir çalışmada deneysel tasarımında dikkate alınmalıdır. Bu yönleriyle ve domuz anatomi, kapsamlı, ayrıntılı, büyük ölçekli örnekleme yönergeleri adapte domuz hayvan modelleri son zamanlarda kurulmuş, özel özellikleri ile ilgili olarak standart, tekrarlanabilir için sağlam bir başvuru sağlayan ve 50’den fazla farklı domuz organ ve dokulara^6,7yedek, yeterince işlenmiş, yüksek kaliteli örneklerinin verimli üretimi.

Metodolojik açıklamaları ve mevcut makalede gösterilen video öğretici detaylı, açıklayıcı, anlaşılır, adım-tarafından adım talimatları için pratik teknikler için volumetry, performansını sağlamak domuz dokuların örnekleme ve organ ve doku örnekleri farklı akış aşağı analiz yöntemleri için işlenmesi. Seçme teknikleri organ/doku birimleri ve Arşimet ve Cavalieri⁹ilkelerine dayanan yoğunlukları belirlenmesi için yöntemleri dahil, üç boyutlu büzülme doku boyutlarının belirlenmesi de dahil olmak üzere ilgili Histolojik inceleme için işleme sırasında farklı gömme medya¹⁴ içinde katıştırma, uygulanabilir hacim ağırlıklı sistematik rastgele örnekleme uygulanması için örneklenen doku örneklerin işleme yaklaşımları farklı sonraki analizleri^7,8,9,15ve nesil uygun şekilde odaklı ve olası nicel stereological analizleri^{7,8için örnekleri işlenebilir, 9,10,11}. Domuz biobank projeleri uygulama onların yanında, kanıtlanmış yöntemleri genellikle nicel histo-Morfolojik özellikleri organ/dokuların inceleyerek tüm çalışmalar için uygundur. Ayrıca, sistematik rastgele örnekleme tasarımlar kuşak temsilcisi örnekleri bereket değişiklikler, örneğin, RNA’ların, proteinler veya metabolitleri içinde algılamak için moleküler analiz yöntemleri kullanarak deneyler için özellikle yararlıdır çeşitli organ ve dokulara.

Pratik performanslarını Protokolü bölümünde anlatılan sonraki paragraflar bu yöntemler kısa bir giriş sağlar.

Organ/doku birimleri belirlenmesi
Bu faktörler gösterebilir organ ağırlık ve birimleri belirlenmesidir dosyasında çeşitli deneysel ayarları, önemli değişiklikler, potansiyel olarak deneysel olarak ilgili faktörler ilgi bileşen incelenir. Bir organ/doku hacmi de genellikle mutlak nicel parametreleri, (örneğin, toplam telefon numarası), stereologically tahmini sayısal ses yoğunluğu (örneğin, birim birim başına hücre sayısı üzerinden hesaplamak için gereklidir doku)^7,12. Bilgisayarlı Tomografi gibi karmaşık teknik ekipman kullanma teknikleri dışında temelde bir organ veya doku mutlak hacmi belirlemek için yaygın olarak kullanılan üç pratik yöntem vardır. Bir organ hacmi “Arşimet, Yaniilkesine göre su veya tamamen sular altında zaman yapı tarafından zorla göç ettirilmiş salin ses düzeyini ölçme doğrudan hacimsel ölçü” tarafından belirlenebilir. Ancak, onlar çok büyük hacimsel/ölçme şişeler gerektiren bu yana nispeten büyük domuz organları için bu yaklaşımlar pratik ve tutarsızlık, eğilimli vardır. Daha rahat bir organ/doku hacmi verimli bir şekilde “batma yöntem”^{7,12 kullanarak belirlenebilir, ağırlık ve yoğunluk7,12,16, hesaplanabilir ,16} (iletişim kuralı adım 1.1.). Organ/doku birimleri de “Cavalieri prensibi” üzerine (1598-1647) göre volumetry yaklaşımları kullanarak tahmin edilebilir. Basitçe, Cavalieri İlkesi devletler, iki nesne için zemin düzlemini paralel uçaklarda kesitli, ve bölümler profilleri iki nesne karşılık gelen edersen taban düzlemi uzaklıklar aynı alanlarda, iki nesne var aynı birim var. Böylece, keyfi olarak şekillendirilmiş nesneleri hacmi paralel, aynı derecede uzak bölüm uçaklar ve bölüm uçaklar arasındaki mesafe bölüm profil alanlarının ürün olarak tahmin edilebilir. Bu aşağıdaki benzetmeyle anlaşılır: aynı sikke aynı sayıda oluşan iki yığınlarını yerleştirilir yan yana birbiri verimli sikke yığını ve diğer silindir şeklinde yığılmış paralar bakıcıyla bir yığın düşünün paralar ile Merkezi kapalı yığın sikke (şekil 3A) konumlandırılmış. Her iki para yığınları şekilleri farklı olmasına rağmen onların birimler alanları, karşılık gelen her iki yığınları düzeylerindeki sikkelerin beri aynıdır (Yani, profilleri paralel bölümlerin alanlarında kesilmiş her iki para eşit uzaklıkta yığınlarda aracılığıyla zemin) aynıdır. Domuz organ ve dokulara Cavalieri ilke^7,12,15 kullanarak hacimli tahmini 1.2. adımda anlatılan.

Histolojik katıştırma için ilgili doku büzülme ölçüde belirlenmesi
Analizler çeşitli kantitatif morfolojik parametreleri histolojik dokusu bölümlerde ölçülen belirlenecek ve göz önünde doku histolojisi için işleme sırasında meydana gelen doku gömme ile ilgili büzülme etkisi var. Katıştırma ilgili doku büzülme ölçüde değişken olabilir ve hem doku, işleme ve gömme orta^{8,13,17,18,19}üzerinde bağlıdır. Genel olarak, tüm üç boyutlu uzay ve bu nedenle, tüm boyutlu parametreleri nicel stereological analizleri^{8 tahmini etkiler katıştırma güvenlikle ilgili değişiklikler (Yani, çoğunlukla büzülme) doku örneği hacminin ortaya} . Temel olarak, gömme ile ilgili doku büzülme, doğrusal doku büzülme faktörü (f_S) ifade edilen ölçüde adım 1.3 gösterildiği gibi tahmin edilebilir. ve¹⁴(büzülme duyarlı) kantitatif morfolojik parametreleri düzeltilmesi için kullanılan.

Organ/dokuların sistematik rastgele örnekleme birimi ağırlıklı
Domuz organ/doku örnekleri biobank topluluğu kurulması için birim ağırlıklı sistematik rastgele örnekleme yaklaşımlar gibi 2. adımda açıklanan pratik, zaman kazandıran ve verimli teknikleri nesil temsilcisi olduğu kanıtlanmıştır, çok amaçlı doku^7,8,9,15örnekler.

Nesil izotropik Uniform rasgele bölümleri ve dikey Uniform rasgele bölümleri nicel stereological analizleri için
Biobank doku örnekleri farklı nicel stereological analiz yöntemleri yeterince hazırlıklı bir numune belirlenemedi parametreleri maksimum tahmini için geniş bir yelpazesi için uygun olması gerekir. Neredeyse tüm nicel stereological parametreleri “izotropik (bağımsız) tek tip rasgele (diploması) bölümler”^8,9kullanılarak belirlenebilir. Doktora diploması bölümlerde, doku örneği bölüm boyutunda üç boyutlu yönünü randomize. Bu doku örneği bölüm uçak konumuna göreceli konumunu randomizasyon tarafından “Isector” yöntemi¹¹ (iletişim kuralı adım 3.1) veya göreli olarak bölüm uçak yönünü randomizasyon uygulandığı haliyle elde edilebilir “Orientator” yöntemi¹⁰ (iletişim kuralı adım 3.2) olduğu gibi doku örneği. Cilt – ya da mukoza numune doğal olarak mevcut veya tanımlanmış ve düzgün tanımlanabilir dikey eksen, “dikey tek tip rasgele (VUR) bölümler” hazırlanması görüntüleme gibi doku örneklerinde (iletişim kuralı adım 3.3.) kesinlikle kesitli boyutunda içinde onların dikey eksen avantajlı^8,20‘ dir. İçin tam bir söylem diploması/VUR örnekleme teorik temelleri ve potansiyel aşağı akım nicel stereological analizleri ile kapsamlı bir tartışma baktılar okuyucu niceliksel stereology hayatta ders kitapları için denir Bilimler^8,9.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada ölü hayvanlardan elde edilen doku örnekleri kullanmak ve tamamen hayvan refahı Alman yasal düzenlemelere uygun. 1. Volumetry Doku/Organ yoğunlukları belirlenmesi için batma tekniği (Resim 1 ve Şekil 2) 7 , 12 , 16 Malzemeleri hazı…

Representative Results

Doku/organ yoğunluk tayini için batma tekniği Şekil 12A -B yoğunluk temsilcisi olarak belirlenmesi ve 1.1 (Resim 1, Resim 2). adımda anlatılan batma tekniği kullanarak bir domuz böbrek hacmi gösterir. Yoğunluk ölçümleri ek domuz organ ve dokuların daha temsilcisi sonuçları Tablo 2′ de sunulmak…

Discussion

Biobank domuz hayvan modelleri örnek koleksiyonlardan nesil organ/doku birimleri, temsilcisi, gereksiz doku örnekleri geniş bir yelpazesi için uygun tekrarlanabilir nesil belirlenmesi için güçlü teknikleri ve protokolleri gerektirir farklı analiz yöntemleri ve nicel stereological analizleri için örnek bölümleri yönünü randomizasyon için. Mevcut makalesinde açıklanan yöntemleri domuz organ ve dokulara boyutları için uyarlanmış ve etkili bir şekilde bu talepleri^2,</sup…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.