고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화
Summary
이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.
Abstract
치경 대 식 세포는 태아 근원의 말기 분화, 폐 상주 대 식 세포. 치경 대 식 세포는 그들의 긴 수명 및 폐 지역화 감염 및 염증 응답 뿐만 아니라 폐 개발 및 기능, 그들의 중요 한 역할에서 고유. 날짜 하려면, 식별, 격리, 및 인간과 쥐에서 치경 대 식 세포의 취급에 대 한 통합된 방법 존재 합니다. 이러한 메서드는 다양 한 실험 설정에서 이러한 중요 한 타고 난 면역 세포에 대 한 연구에 대 한 필요 하다. 쉽게 어떤 연구소에 의해 채택 될 수 있습니다, 여기에, 설명 하는 방법을 bronchoalveolar 게 액체 또는 폐 조직에서 치경 대 식 세포를 수확 하 고 그들 에 시험관을 유지 하는 간단한 접근 방법입니다. 치경 대 식 세포는 폐 포에 부착 세포로 주로 발생 하기 때문에이 방법의 초점은 수확 및 식별 하기 전에 그들을 dislodging에 있습니다. 폐는 매우 vascularized 기관 그리고 골수성과 림프 근원의 다양 한 셀 형식 서식, 상호 작용, 폐 microenvironment에 의해 좌우 된다. 여기 설명 된 표면 마커 집합을 사용 하 여 연구원 수를 쉽고 명확 하 게 다른 백혈구에서 치경 대 식 세포를 구별 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들을 정화. 여기 개발 문화 메서드 두 인간을 지원 하 고 치경 대 식 세포에 체 외 성장에 대 한 마우스 세포질이 고 분자 연구와 호환 됩니다.
Introduction
폐 microenvironment 정교한 공기 도관, 맥 관 구조는 고유 하 게 복잡 한 생태계 이다. 흡입된 공기 혈액 공기 가스 교환 발생 하는 위치는 폐 포에 도달 하기 전에 기관 그리고 기관지 및 bronchioles의 수많은 분 지를 통해 여행. 분위기와 직접 상호 작용을 인해 호흡기 표면 공 수 입자와 오염 물질의 잠재적으로 유해한 영향 으로부터 보호를 요구 한다. 다양 한 물리, 화학, 및 면역학 장벽 폐를 보호합니다. 특히, 호흡기 표면에 phagocytes의 배포는 중요 한 첫 번째-라인 방어 시스템을 제공합니다. 치경 세포 (AMs)는 한 가지 유형의 폐 상주 식 세포, 그리고 그들은 폐 대 식 세포 수영장의 대부분을. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, AMs 주로 치경 루멘에 지역화 하 고 지속적으로 주변 분위기를 샘플 하 고 치경 상피1와 통신 하는 무 셀으로 발생 합니다. 정상 상태 폐에서 치조 공간에서 식 세포의 95%는 AMs2, 염증, 감염, 또는 오염 물질에 만성 노출의 구성을 변경할 수 있습니다.
AMs 폐에 로컬 될 수 있는 함수 및/또는 조직의 중요성의 광범위에 참가 한다. 예를 들어 AMs는 개발 및 폐;의 최적의 기능에 필수적 면역 감시; 그리고 세포 파편, 병원 균와 흡입된 입자3,,45,,67의. AMs의 타겟된 고갈 호흡기 바이러스 및 박테리아4,8의 손상으로 알려져 있다. 식 세포와 폐 항상성의 첫 줄 수비수로 서 자신의 역할, 외 AMs 알려져 있습니다 T 도출에 세포를 항 원 제시 세포 면역9, 작동 potentiating intranasal 백신10 의 효능과 폐 이식11,12후 폐 제한 면역에 영향을 미치는. 오전 기능 결핍 폐 치조 proteinosis (PAP), 유전자 변이, 악성 종양 또는 감염 폐 계면 활성 제13,14의 손상 발생 조건에 연결 되었습니다. AMs의 이식 PAP 15,16의 처리를 위한 치료 방법으로 탐험 되 고 지금입니다.
AMs는 embryogenesis 동안 발생 하 고 인생을 통해 폐 순환 백혈구2,17로 대체 되 고 없이 유지 알려져 있습니다. 오전 매출의 다양 한 수준의 인플루엔자 바이러스4, myeloablative 조사18도에 노출에 의해 감염을 포함 하 여 특정 임상 상황에 보고 되었습니다 비록, 오전 회전율 homeostatic 폐에서 감지, 19, 그리고 나이20. AMs는 낮은 확산17,21를 통해 자기 갱신으로 하지만 일부 최근 연구 monocytes 혈관 내 폐 세포22,23 아래에서 인구를 야기할 수 있는 주장 하지만 이러한 새로 변환 된 폐 세포의 기능 실험 조건, 폐 질환에 정의 하 아직 있다. 또한, 폐 염증 신호 및 immunoregulatory 기계 사이 균형을 유지 하는 시도 잠재적으로 흥미로운 영역입니다 오전 활성화의 맥락에서 자극의 임계값을 이해.
면역 규칙의 손실 생리 또는 pathologic 변경 다양 한 임상 설정 (예: 호흡기 감염, 염증 성 폐 질환과 거리 폐 질환)에서 평가에 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, AMs는 지표 또는 폐 건강11,24의 심지어 결정 요인으로 점점 인식 된다. 현재, 수확, 특성화, 또는 인간 및 전 임상 murine 모델에서 유지 AMs 사용할 수 없는 통합된 프로토콜 있습니다. 오전 선구자 및 고기, 합의의 부족 및 상세한 방법론의 부재 폐 건강 및 질병에 오전의 해독 역할에서 주요 장애물이 있었다. 다음 프로토콜 최종 식별, 격리 및 생체 외에서 문화 전략을 크게 오전 동작의 이해를 전진 하 고 오전 대상으로 진단 및 치료 연구를 용이 하 게 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs는 출생 시 시작 및26의 전체 수명 동안 지속 폐를 채우는 긴-생활 폐 상주 세포. 폐 생리학7 과 병리학12 및 폐 면역24 의 그들의 잠재력에서 그들의 역할을 인정 받고 있다. AMs 폐11,27 에 있는 장기 존재와 그들이 활성화 및 면역 반응11,24…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고 편집 도움에 감사 클레어 Prendergast 하 고. DKN 지원 연구 러닝 재단에서 (#2095) 부여 및 TM는 건강의 국가 학회 (R01HL056643 및 R01HL092514)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. DKN는 방법을 개발 하 고 연구를 설계 하 고, 쓴 원고; OM 지원 동물 연구와 임상 샘플 조달; SB 지원 흐름 cytometric 분석 및 세포 분류; TM 연구를 감독 하 고 원고를 검토.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
Riferimenti
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