Method Article

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

DOI:

10.3791/57287

⸱

April 20th, 2018

 ,  ,  , 
1Norton Thoracic Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center, 2Flow Cytometry Core, St. Joseph's Hospital and Medical Center

In This Article

Summary

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La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Abstract

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I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all'infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l'identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.

Introduction

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Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell'aria elaborata e sistema vascolare. L'aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l'atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi....

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center.

1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL)

  1. Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.
  2. Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventr....

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Results

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L'approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l'analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verific.......

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Discussion

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AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l' intero ciclo di vita26. Loro ruolo nella fisiologia polmonare7 e patologia12 e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare24 è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni11,27 e perché sono coinvolti nell'attivazi.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.

Acknowledgements

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Ringraziamo Clare Prendergast per assistenza con il manoscritto di editing. DKN è supportato da una ricerca concedere (n. 2095) della Fondazione di Flinn e TM è supportato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN ha sviluppato i metodi, progettato lo studio e ha scritto il manoscritto; OM assistito con gli studi sugli animali e gli acquisti di campioni clinici; SB assistita con analisi cytometric di flusso e ordinamento delle cellule; TM sotto la supervisione degli studi e il manoscritto è esaminata.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soluzione dissociante cellulare non enzimaticaMillipore-SigmaC5789
Puralube Vet UnguentoDechra620300
22G CatetereTerumo Medical ProductsSR-OX2225CA
4-0 Sutura intrecciata in seta non assorbibile Kent ScientificSUT-15-2
Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato Corning21-031-CM
Blocco Fc per mouse BD Biosciences553142
Tampone di lisi (kit di RNA PureLink)Thermo Fisher Scientific 12183018A
b-Mercaptoetanolo Millipore-SigmaM6250 
Selezionatore cellulare FACSAria II BD Biosciences644832
Ketamina  (Ketathesia)Henry Schein56344
Xilazina  (AnaSed)Akorn139-236
RPMI 1640Corning10-040-CM
DMEMCorning10-017-CM
Liberase TL Millipore-Sigma5401020001
DNasi IMillipore-SigmaAMPD1-1KT
100μ filtro cellulare m Corning352360
Blocco Fc umanoBD Biosciences564220
EDTACorning46-034-CI
Contacellule automatizzato Countess IIThermo Fisher Scientific 
Soluzione blu di tripanoThermo Fisher Scientific 
HEPESCorning25-060-CI
Siero fetale bovinoAtlanta BiologicalsS11150H
linea cellulare L-929Type Culture CollectionATCC,  CCL-1
Penicillina/Streptomicina Corning30-002-CI
Piruvato di sodioCorning25-000-CI
T25 Pallone per coltura tissutaleThermo Fisher Scientific 
piatto di coltura da 60 mm Millipore-SigmaCLS3261
15 mL Provetta conica Corning352097
provetta conica da 50 mLCorning352098
LSRControllo cellulare di erbaBD Biosciences657669
FlowJoFlowJov10.4Software di analisi
Anti-CD45 (Topo)Biolegend147709Clone I3/2.3, FITC coniugato
Anti-CD11b (Topo)Biolegend101228Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 coniugato
Anti-CD11c (Topo)BD Biosciences565452Clone N418, BV 421 coniugato
Anti-I-Ab (Topo)Biolegend116420Clone AF6-120.1, PE/Cy7 coniugato
Anti-Siglec-F (Topo)BD Biosciences562757Clone E50-2440, PE-CF594 coniugato
Anti-Siglec-H (Topo)Biolegend129605Clone 551, PE coniugato
Anti-F4/80 (Topo)Biolegend123118Clone BM8, APC/Cy7 coniugato
Anti-Ly-6C (Topo)Biolegend128035Clone HK1.4, BV605 coniugato
Anti-CD64 (Topo)Biolegend139311Clone X54-5/7.1, BV711 coniugato
Anti-CD24 (Topo)BD Biosciences563115Clone M1/69, BV510 coniugato
Anti-CD103 (Topo)BD Biosciences745305Clone OX-62, BV650 coniugato
Anti-CD317 (Topo)Biolegend127015Clone 927, APC coniugato
Anti-CXCR1 (Topo)Biolegend149029Clone SA011F11, BV785 coniugato
Anti-CD45 (Umano)Biolegend304017Clone HI30, AF488 coniugato
Anti-CD11b (Umano)Biolegend101216Clone M1/70, PE/Cy7 coniugato
Anti-HLA-DR (Umano)Biolegend307618Clone L243, APC/Cy7 coniugato
Anti-CD169 (Umano)Biolegend346008Clone 7-239, APC coniugato
Anti-CD206 (Umano)Biolegend321106Clone 15-2, PE coniugato
Anti-CD163 (Umano)Biolegend333612Clone GHI/61, BV421 coniugato
AMQAX100015250061 American 156367

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages devel....

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Alveolar MacrophagesBronchoalveolar LavageFlow CytometryCell IsolationTissue DigestionCell CultureSurface MarkersCD45 PositiveCD11c PositiveSiglec F Positive

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