I nuværende undersøgelse, vi beskriver en metode til at analysere C924T genotype. Protokollen består af tre faser: DNA-ekstraktion, forstærkning af Polymerasekædereaktionen (PCR) og analyse af begrænsning fragment længde polymorfisme (RFLP) på agarosegel.
Tromboxan A2 receptor (TBXA2R) genet er medlem af G-protein koblet superfamilien med syv-transmembrane regioner. Det er involveret i atherogenesis progression, iskæmi, og myokardieinfarkt. Her præsenterer vi en metode for patient genotypebestemmelse at undersøge C924T-polymorfisme (rs4523) beliggende på regionen 3′ af TBXA2 receptor genet post-transcriptional rolle. Denne metode er baseret på DNA-ekstraktion fra fuldblod, polymerase kædereaktion (PCR) forstærkning af TBXA2 gen del indeholdende C924T mutation, og identifikation af vildtype og/eller mutant genotyper ved hjælp af en begrænsning digest analyse, specifikt en restriktion fragment længde polymorfisme (RFLP) på Agarosen gel. Derudover blev resultaterne bekræftet af sekventering TBXA2R genet. Denne metode har flere potentielle fordele, såsom høj effektivitet og hurtig identifikation af C924T polymorfi af PCR og begrænsning enzym analyse. Denne tilgang giver mulighed for en intelligent undersøgelse for plak dannelse og åreforkalkning progression ved at analysere patient genotyper for TBXA2R C924T-polymorfisme. Anvendelsen af denne metode har potentiale til at identificere emner, der er mere modtagelige for aterotrombotiske processer, i bestemte fag i et højrisiko, aspirin-behandlede gruppe.
TBXA2R er medlem af G-protein koblet superfamilien med syv-transmembrane regioner, som er bredt udtrykt og lokaliseret cellemembraner eller på intracellulære strukturer1,2. TBXA2R signalvejen er involveret i avanceret aterosklerotisk processer3. Øget udtryk for TBXA2 receptoren var dokumenteret under atherogenesis progression og kliniske og eksperimentelle undersøgelser viste sin relevant rolle i iskæmi og myokardieinfarkt4. C924T, en enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) af TBXA2R-genet, blev anerkendt som en funktionel polymorfi i raske frivillige og har været forbundet med kliniske lidelser5. Desuden, vores tidligere undersøgelse6 demonstreret at C924T polymorfi af TBXA2R-genet er involveret i afskriften stabilitet; specifikt, er der en øget ustabilitet af mutant (TT) type afskriften med hensyn til vildtype (CC). Derudover induceret flere stimuli som adenosin ud (ADP), adrenalin og kollagen i forskellige koncentrationer en trombocytaggregation mindre effektiv for den mutante type (TT). Dette er i overensstemmelse med en reduceret blodprop dannelse og hæmostase. Således kan ustabilitet i TBXA2R udskrift og den dermed forbundne reduktion af trombocytaggregation være forbundet med en beskyttende rolle for TBXA2R TT genotype mod atherothrombosis og dens komplikationer i højrisiko aspirin-behandlede patienter6 .
Her, beskriver vi en metode til patient genotypebestemmelse at undersøge C924T polymorfisme (rs4523) beliggende på regionen 3′ af TBXA2 receptor genet post-transcriptional rolle. Denne metode bygger på følgende trin: (1) DNA-ekstraktion fra fuldblod, (2) PCR-amplifikation af TBXA2R gen del indeholdende C924T mutation, og (3) identifikation af vildtype og/eller mutant genotyper ved hjælp af begrænsning fragment længde polymorfisme (RFLP) på agarosegel. RFLP er en teknik, der udnytter variationer i homologe DNA sekvenser7. Denne ansøgning blev brugt til at påvise DNA polymorfier, især SNPs, og til at finde og knytte biologisk relevans i genetiske variationer8. Polymorfi analyseret for første gang ved hjælp af RFLP-PCR hos mennesker var ABO blod9. RFLP-PCR-metoden giver mulighed for analyse af genetiske mutationer i homologe DNA sekvenser ved at vurdere tilstedeværelsen af fragmenter af forskellige længder efter DNA fordøjelsen ved hjælp af meget specifikke restriktionsendonukleaser10.
I sidste år, de følgende metoder har været udnyttet til SNP analyse ved hjælp af PCR teknik: hybridisering af korte allel-specifik oligonukleotider11, allel-specifik PCR12, primer udvidelse på DNA microarrays13, oligonukleotid ligatur assay14, direkte DNA sekvensering til at identificere holdning-specifikke enkelt-nukleotid polymorfier15, Taqman metode16, udvinding () Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight MALDI-TOF) massespektrometri17og GeneChips18. Disse teknikker er ikke enkle at bruge og kan kræve dyrt udstyr. Omvendt, PCR-RFLP metode er billig, enkel at bruge, praktisk, har en høj effektivitet, og giver mulighed for hurtig identifikation af C924T-polymorfisme. Desuden bekræftede vi resultaterne af sekventering TBXA2R gen ved hjælp af Sanger metode15.
Denne tilgang giver mulighed for en intelligent undersøgelse af plak dannelse og åreforkalkning progression ved at analysere patient genotyper for TBXA2R C924T-polymorfisme. Denne metode kunne identificere emner mere modtagelige for aterotrombotiske processer, især dem blandt højrisiko, aspirin-behandlede patienter.
I den foreliggende undersøgelse, har vi beskrevet en metode, der giver patienten genotypebestemmelse for at undersøge C924T polymorfisme (rs4523) beliggende på regionen 3′ af TBXA2R-genet post-transcriptional rolle. Første, denne metode er baseret på DNA-ekstraktion fra fuldblod. Især består denne første proces af en rensning af samlede menneskelige DNA, genomisk og mitokondriel, fra hele blodprøver friske eller frosne, behandlet med EDTA (citrat eller heparin). Kortvarig oplagring af hele blodprøver, opbevares ved 2-8 ° C i op til 10 dage. For oplagring over 10 dage, opbevare prøver ved-70 ° C. Den automatiserede rensningsprocessen består af 4 trin: lyse, binder, vaske og elueres. For det andet bygger metoden på PCR-amplifikation af TBXA2R gen del indeholdende C924T mutation. Endelig udføres identifikation af vildtype og/eller mutant genotype ved hjælp af en Restriktionsenzymanalyse (RFLP) på agarosegel.
Kritiske trin i protokollen er følgende: (i) i tilfælde af at en del af agarosegel gemt på RT er anvendt, den størknede Agarosen kan være re opløst over et bad med kogende vand (ved 60 ° C i ca 15-20 min) eller i en mikrobølgeovn (3-5 min) før hælde. Bemærk: Løsn fælles landbrugspolitik, når omsmeltning Agarosen i en flaske. (ii), endvidere, når re varme agarosegelelektroforese, fordampning vil forårsage en stigning på dets koncentration. Derfor kunne det være nyttigt at kompensere ved at tilføje en lille mængde vand. (iii) DNA fragmenter af mindre end 1.000 bp blev differentieret af agarosegel, og TBE buffer anbefales at få den bedst mulige adskillelse. (iv) vi foretrækker at bruge en agarosegel snarere end en polyacrylamid gel, fordi udarbejdelsen af sidstnævnte er vanskeligere, og det tager meget længere tid at oprette. (v) valget af køretid på gelelektroforese er afhængig af den forventede størrelse af forstærkning produkter. Baseret på denne protokol, er det tilstrækkeligt at udføre en elektroforese for 20-30 min. ved 100 V i 2%-agarosegel, da størrelsen af PCR fragmenter spænder fra 100-500 bp. (vi) det er obligatorisk at opnå 10 til 50 ng af en god kvalitet skabelon DNA ekstraheret fra menneskelige prøver . Af denne grund foretrækker vi at bruge en automatiseret DNA-oprensning i stedet en semi-automatisk eller manuel. (vii) Forbered master-mix reaktion til PCR-amplifikation og master-mix løsning til PCR produkter fordøjelse, tilføjer 10% mere (for at tage hensyn til tab af væske under pipettering) til volumen beregnet ganget med antallet af prøver for volumen kræves for en DNA prøve.
Den hyppigste faldgrube i metoden er tilstedeværelsen af ekstra forstærkning produkter på grund af en forkert termisk cycler program, en forkert forstærkning master-mix forberedelse eller en DNA-skabelon forurening. Desuden, mangel af PCR produkter kan skyldes inaktiverede Taq -polymerase eller en forkert termisk cycler køre. Derudover kan tilstedeværelsen af uventede fragmenter være på grund af PCR produktkontaminering eller en ufuldstændig fordøjelse fra enten en inaktiveret enzym, alt for lille mængde begrænsning enzym volumen eller en for kort inkubationstiden.
I de seneste år, de følgende metoder har været udnyttet til SNP analyse ved hjælp af PCR teknik: hybridisering af korte allel-specifik oligonukleotider11, allel-specifik PCR12, primer udvidelse på DNA microarrays13 , oligonukleotid ligatur assay14, direkte DNA-sekventering til at identificere holdning-specifikke enkelt-nukleotid polymorfier15, Taqman metode16, udvinding Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri17, og GeneChips18. Disse metoder er ikke ideel, fordi de ikke er enkel at bruge og/eller kræver dyrt udstyr. Omvendt, PCR-RFLP-metoden i denne undersøgelse er billig, enkel at bruge, praktisk, har en høj effektivitet, og giver mulighed for hurtig identifikation af C924T-polymorfisme. En begrænsning for den nuværende metode er, at det kun kan bruges til et lille antal SNPs og for et par prøver i en arbejdssession.
For fremtidige ansøgninger, kan denne metode bruges til prædiktive undersøgelser vedrørende plak dannelse og åreforkalkning progression ved at analysere de patient genotyper for TBXA2R C924T-polymorfisme. Desuden, denne metode kunne identificere emner mere modtagelige for aterotrombotiske processer, navnlig højrisiko patienter behandlet med aspirin. Endelig vil denne metode kunne anvendes til at studere andre polymorfier involveret i personlig medicin for specifikke stoffer (f.eks antikoagulantia og antikonvulsiva) for at forstå den passende lægemiddeldosering og den enkelte farmakologiske og klinisk respons for hver patient, før du begynder behandling og at undgå skadelige virkninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev delvist finansieret af 60% Ateneo tilskud fra Ministero dell’Università, Italien S.M. og E.T. Vi har også modtaget delvis bidrag til forskning udgifter ved Institut for medicinsk, Oral og bioteknologiske videnskaber, universitetet i Chieti “G. d’Annunzio”.
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |