Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

Renee Wei-Yan Chow; Paola Lamperti; Emily Steed; Francesco Boselli; Julien Vermot

doi:10.3791/57290

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Articolo metodologico

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

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DOI:

10.3791/57290

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20 febbraio 2018

Renee Wei-Yan Chow^*¹^,²^,³^,⁴ , Paola Lamperti^*¹^,²^,³^,⁴ , Emily Steed¹^,²^,³^,⁴ , Francesco Boselli¹^,²^,³^,⁴ , Julien Vermot¹^,²^,³^,⁴

¹Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, ²UMR7104, Centre National de la Recherche Scientifique, ³U964, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, ⁴Université de Strasbourg

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per fotoconversione di Kaede proteina fluorescente in cellule endocardial del vivente degli embrioni di zebrafish che consente il tracciamento delle cellule endocardial durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e del canale atrioventricolare .

Abstract

Durante l'embriogenesi, le cellule subiscono cambiamenti dinamici nel comportamento delle cellule e decifrare la logica cellulare dietro a questi cambiamenti è un obiettivo fondamentale nel campo della biologia dello sviluppo. La scoperta e lo sviluppo di proteine di fotoconvertibile hanno aiutato la nostra comprensione di questi cambiamenti dinamici fornendo un metodo per evidenziare otticamente cellule e tessuti. Tuttavia, mentre fotoconversione, time-lapse microscopia e analisi delle immagini successive hanno dimostrato di essere molto successo nel scoprire dinamica cellulare in organi come il cervello o l'occhio, questo approccio è generalmente non utilizzato nel cuore in via di sviluppo a causa sfide posate dal movimento rapido del cuore durante il ciclo cardiaco. Questo protocollo è costituito da due parti. La prima parte descrive un metodo per photoconverting e successivamente tracking endocardial cellule (EdCs) durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e zebrafish canale atrioventricolare (AVC). Il metodo prevede di fermare temporaneamente il cuore con un farmaco in ordine per fotoconversione accurata a prendere posto. I cuori sono permesso di riprendere pestaggio dopo l'estrazione della droga e lo sviluppo embrionale prosegue normalmente fino a quando il cuore è fermato di nuovo per l'imaging ad alta risoluzione di photoconverted CDE in un momento dello sviluppo più tardi. La seconda parte del protocollo descrive un metodo di analisi di immagine per quantificare la lunghezza di una regione photoconverted o non photoconverted in AVC in giovani embrioni mappando il segnale fluorescente dalla struttura tridimensionale su una mappa bidimensionale . Insieme, le due parti del protocollo permette di esaminare l'origine e il comportamento delle cellule che compongono il zebrafish AVC e valvola cardiaca atrioventricolare e potenzialmente può essere applicato per lo studio di mutanti, morphants o embrioni che sono stati trattati con reagenti che interrompono lo sviluppo AVC e/o la valvola.

Introduzione

Zebrafish è attualmente uno dei più importanti modelli vertebrati per studiare i processi cellulari e dello sviluppo in vivo. Ciò è in gran parte dovuto trasparenza ottica di zebrafish e disponibilità allo studio della genetica, che lo rende un potente modello per l'applicazione di tecniche ottiche che coinvolgono geneticamente codificato fotoresponsivi proteina tecnologie¹. Specifico per lo studio dello sviluppo del cuore, zebrafish ricevere sufficiente ossigeno tramite diffusione tale che persino mutanti senza battito cardiaco possono sopravvivere attraverso la prima settimana di sviluppo, permettendo analisi sugli effetti dei geni d....