حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد
Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب فوتوكونفيرسيون كايد الفلورسنت البروتين في الخلايا للوفلر المعيشة الجنين الزرد التي تمكن من تتبع الخلايا للوفلر خلال قناة بي وتطوير صمام قلب بي .
Abstract
أثناء امبريوجينيسيس، خلايا تغيرات دينامية في سلوك الخلية، وفك رموز الخلوية المنطق الكامن وراء هذه التغيرات هدف أساسي في مجال علم الأحياء التنموي. اكتشاف وتطوير فوتوكونفيرتيبلي البروتينات ساعدت إلى حد كبير فهمنا لهذه التغيرات الدينامية بتوفير أسلوب بصريا تسليط الضوء على الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، بينما فوتوكونفيرسيون والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، وتحليل الصور اللاحقة أثبتت أن تكون ناجحة جداً في الكشف عن ديناميات الخلوية في الأجهزة مثل الدماغ أو العين، هذا النهج لا يستخدم عادة في القلب النامية المستحقة التحديات التي تفرضها الحركة السريعة للقلب أثناء دورة القلب. يتألف هذا البروتوكول من جزأين. ويصف الجزء الأول أسلوب فوتوكونفيرتينج وبعد ذلك تتبع الخلايا للوفلر (EdCs) خلال قناة بي الزرد (افك) وتطوير صمام قلب بي. الأسلوب الذي ينطوي على وقتيا توقف القلب بدواء من أجل فوتوكونفيرسيون دقيقة تأخذ مكان. قلوب هي السماح باستئناف الضرب عند إزالة المخدرات والتنمية الجنينية يستمر عادة حتى يتم إيقاف القلب مرة أخرى لتصوير عالي الدقة من فوتوكونفيرتيد يشكل نقطة بعد ذلك وقت التنموية. ويصف الجزء الثاني من البروتوكول أسلوب تحليل صورة لقياس طول منطقة فوتوكونفيرتيد أو غير فوتوكونفيرتيد بافك في الأجنة الشباب عن طريق تعيين إشارة الفلورسنت من هيكل ثلاثي الأبعاد على مخطط ثنائي الأبعاد . معا، الجزأين من البروتوكول يسمح أحد لدراسة منشأ والسلوك من الخلايا التي تشكل الزرد افك وصمام القلب بي، ويمكن تطبيقها المحتمل لدراسة طفرات أو مورفانتس أو الأجنة التي قد تم التعامل مع الكواشف التي تعطل التنمية افك و/أو صمام.
Introduction
الزرد حاليا واحدة من أهم نماذج الفقاريات لدراسة العمليات الخلوية والإنمائية في فيفو. هذا إلى حد كبير بسبب الشفافية الضوئية الزرد وقابليتها لعلم الوراثة، مما يجعلها نموذجا قويا لتطبيق التقنيات البصرية التي تشمل وراثيا ترميز فوتوريسبونسيفي البروتين التكنولوجيات1. محددة لدراسة التطور القلب، الزرد تلقي الأوكسجين كافية عن طريق نشر أن طفرات حتى دون ضربات القلب يمكن البقاء على قيد الحياة من خلال الأسبوع الأول من التنمية، تسمح التحاليل على الآثار من جينات التنموية والقلق تدفق الدم في القلب morphogenesis ليس من الممكن في معظم الفقاريات2.
ويتكون أنبوب القلب الزرد خلال 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf). بعد وقت قصير من تشكيلها، يبدأ أنبوب القلب الضرب بنشاط. 36 هبف، انقباض واضح يفصل الأتريوم من البطين. يتم استدعاء هذه المنطقة من انقباض قناة بي (افك)، والخلايا في هذا التغيير المنطقة من مورفولوجيا صدفية إلى مورفولوجيا cuboidal3. الزرد صمام بي morphogenesis يبدأ حوالي 48 ساعة بعد الإخصاب. قبل 5 أيام بعد الإخصاب، واثنين من منشورات صمام تمتد إلى افك ومنع عودة تدفق الدم من البطين إلى الاذين أثناء دورة القلب4. تعقب الخلايا أثناء تشكيل افك وصمام تتحدى الضرب السريع للقلب يجعل من الصعب متابعة الخلايا عن طريق الفحص المجهري التقليدي في الوقت الفاصل بين5،6. ويصف هذا البروتوكول، مقتبس من ستيد et al., 20167، أسلوب يستخدم تيراغرام (fli1a:gal4FFيو بي إس، UAS:kaede)8 الزرد المعدلة وراثيا الخط، الذي أعرب فيه عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي كايد في خلايا بطانية، بما في ذلك في البطانة. المخدرات 2، 3-بوتانيديوني-2-مونوكسيمي (متخذي قرارات العمل) تستخدم لإيقاف مؤقتاً قلب الضرب، مما يسمح فوتوكونفيرسيون دقيقة ليشكل بين 36 و 55 هبف، وتصوير عالي الدقة من فوتوكونفيرتيد يشكل نقطة زمنية إنمائية محددة. لقد ثبت سابقا أن يشكل فوتوكونفيرتيد باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن تبقى مميزة من جيرانهم غير محولة لمدة خمسة أيام أو أكثر بعد وقت فوتوكونفيرسيون7. هذا البروتوكول أيضا تفاصيل أسلوب يستخدم لتحليل الصور من فوتوكونفيرتيد يشكل في أجنة أصغر سنا من 48 هبف، التي استخدمت بنجاح متابعة تحركات الأنسجة خلال افك التنمية (بوسيلي et al.، في الصحافة)9. ونأمل أن القراء سوف تجد هذا البروتوكول مفيدة لدراسة التنمية افك وصمام في الأجنة العادية، وطفرات أو مورفانتس أو الأجنة المعالجة بالعقاقير. لبروتوكول أعم تتصل بخلية تتبع استخدام البروتينات فوتوكونفيرتيبلي أثناء تطوير الزرد، الرجاء عرض المقالة لومباردو et al.، 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
توقيت فوتوكونفيرسيون: “كايد على الرغم من أن” يظل الزاهية المعرب عنها في EdCs حتى في 96 هبف، تجدر الإشارة إلى أنه مع نمو الجنين، ضوء الليزر ينشر المزيد قبل أن تصل إلى افك، يزيد من صعوبة فوتوكونفيرسيون المحصورة من كايد. الجنينية وفي مراحل يتجاوز 55 هبف، يعني تضخم في البطين والاذين أيضا أن شعا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أن-لور Duchemin ودينيس Duchemin، ناتالي فاجيانيلي وجورتشينكوف باسيل للمساعدة في تصميم وصنع العفن الموصوفة في هذا البروتوكول. وأيده عمل هذه العلاجات (DEQ20140329553)، وكالة الاستخبارات الوطنية (ANR-15-CE13-0015-01، ANR-12-ISV2-0001-01)، البرنامج محقق الشباب التطريز، الجماعة الأوروبية، ن منسق الإغاثة الطارئة CoG ° 682938 افالفي ومن منحة ANR-10-لابكس-0030-إينرت، يديره صندوق الدولة الفرنسية الوكالة الوطنية للبحث تحت دعفينير يشرف البرنامج الإطار المسمى ANR-10-معرض أيدكس-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
Riferimenti
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
