Følgende endokardial væv bevægelser via celle Photoconversion i zebrafisk Embryo
Summary
Denne protokol beskriver en metode til photoconversion af Kaede fluorescerende proteiner i endokardial celler levende zebrafisk embryon, der muliggør sporing af endokardial celler under atrioventrikulær canal og atrioventrikulær hjertet ventilen udvikling .
Abstract
Under embryogenese, celler undergå dynamiske ændringer i celle adfærd og decifrere cellulære logikken bag disse ændringer er et grundlæggende mål inden for udviklingsmæssige biologi. Opdagelse og udvikling af photoconvertible proteiner har stærkt hjulpet vores forståelse af disse dynamiske ændringer ved at give en metode til optisk fremhæve celler og væv. Men mens photoconversion, time-lapse mikroskopi og efterfølgende billedanalyse har vist sig for at være meget vellykket i afsløring cellulære dynamics i organer såsom hjernen eller øjet, denne tilgang er generelt ikke bruges i udviklingslandene hjertet grund udfordringerne i forbindelse med den hurtige bevægelse i hjertet i løbet af hjertets cyklus. Denne protokol består af to dele. Den første del beskriver en metode til photoconverting og efterfølgende sporing endokardial celler (EDC) under zebrafisk atrioventrikulær kanalen (AVC) og atrioventrikulær hjertet ventilen udvikling. Metoden indebærer tidsligt stoppe hjertet med et stof i ordre til nøjagtig photoconversion skal finde sted. Hjerter er tilladt at genoptage slå efter udtagning af narkotika- og embryonale udvikling fortsætter normalt indtil hjertet stoppes igen for høj opløsning billeddannelse af photoconverted EDC for en senere udviklingsmæssige tidspunkt. Den anden del af protokollen beskriver et billede analysemetode for at kvantificere længden af en photoconverted eller ikke-photoconverted regionen i AVC i unge embryoner ved at kortlægge den fluorescerende signal fra de tre-dimensionelle struktur på en to-dimensionel kort . Sammen, de to dele af protokollen tillader en at undersøge oprindelsen og opførsel af celler, der udgør den zebrafisk AVC og atrioventrikulær hjerteklap, og kan potentielt anvendes til at studere mutanter, morphants eller embryoner, der er blevet behandlet med reagenser, der forstyrrer AVC og/eller ventil udvikling.
Introduction
For zebrafisk er i øjeblikket en af de vigtigste hvirveldyr modeller til at studere cellulær og udviklingsmæssige processer i vivo. Dette skyldes hovedsageligt den zebrafisk optisk åbenhed og imødekommenhed til genetik, hvilket gør det en kraftfuld model for anvendelsen af optiske teknikker der involverer genetisk kodet photoresponsive protein technologies1. Specifikke undersøgelse af hjertet udvikling, zebrafisk modtage tilstrækkelig ilt via diffusion sådan, at selv mutanter uden hjerteslag kan overleve gennem den første uge af udvikling, tillader analyser af virkningerne af udviklingsmæssige gener og foruroliget blodgennemstrømning på hjertet morfogenese ikke muligt i de fleste hvirveldyr2.
Zebrafisk hjerte tube er dannet af 24 timer post befrugtning (hpf). Kort efter sin dannelse starter hjerte tube aktivt slå. 36 hpf, en klar konstriktion adskiller atrium fra ventriklen. Denne region af konstriktion kaldes atrioventrikulær kanalen (AVC) og celler i denne region ændring fra en planocellulære morfologi til en cuboidal morfologi3. Zebrafisk atrioventrikulær ventil morfogenese starter omkring 48 h post befrugtning. 5 dage til at bogføre befrugtning, to ventilen foldere udvide AVC og forhindrer tilbage flow af blod fra ventriklen til atriet under hjertets cyklus4. Spore celler under AVC og ventil dannelse udfordrende som den hurtige slå af hjertet gør det vanskeligt at følge celler via traditionelle time-lapse mikroskopi5,6. Denne protokol, tilpasset fra hest et al., 20167, beskriver en metode, der bruger Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafisk transgene linjen, hvor photoconvertible protein Kaede er udtrykt i endotelceller, herunder endokardiet. Stof 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) bruges for midlertidigt at stoppe hjertet slå, gør det muligt nøjagtig photoconversion af EDC mellem 36 og 55 hpf og høj opløsning billeddannelse af photoconverted EDC på specifikke udviklingsmæssige tidspunkter. Det er tidligere påvist, at EDC photoconverted ved hjælp af denne metode kan forblive adskiller sig fra deres ikke-konverterede naboer i fem dage eller mere efter tidspunktet for photoconversion7. Denne protokol beskriver også en metode, der anvendes til billedanalyse af photoconverted EDC i embryoner yngre end 48 hpf, som med held har været anvendt til at følge væv bevægelser under AVC udvikling (Boselli et al., i pressen)9. Vi håber, at læserne ville finde denne protokol nyttigt for at studere AVC og ventil udvikling i normal embryoner og i mutanter, morphants eller de behandlede embryoner. For en mere generel protokollen til celle sporing ved hjælp af photoconvertible proteiner under zebrafisk udvikling, se venligst artiklen af Lombardo et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
Timing af photoconversion: selv om Kaede forbliver smukt udtrykte i EDC selv på 96 hpf, det skal bemærkes, at som fosteret vokser, laserlys diffunderer mere før det når AVC, vanskeliggør begrænset photoconversion af Kaede. At embryonale etaper senere end 55 hpf, ballooning af ventriklen og atrium også betyder, at den violette laserstråle bruges til photoconversion ikke kan nå AVC celler uden først at passere gennem enten atrium eller ventrikel. Det betyder, at ud over 55 hpf, for at photoconvert EDC af…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli og Basile Gurchenkov for at hjælpe med at designe og gøre formen beskrevet i denne protokol. Dette arbejde blev støttet af FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO Young Investigator Program, det Europæiske Fællesskab, ERC CoG N ° 682938 Evalve og af grant ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk statens fond forvaltet af Agence Nationale de la Recherche under ramme program Investissements d’Avenir mærket ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
Riferimenti
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
