Følgende Endocardial vev bevegelser via celle Photoconversion i sebrafisk Embryo
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for photoconversion av Kaede fluorescerende proteinet i endocardial cellene levende sebrafisk embryo som muliggjør sporing av endocardial celler under atrioventrikulær kanalen og atrioventrikulær hjertet ventil utvikling .
Abstract
Under embryogenesis, celler gjennomgå dynamiske endringer i celle atferd og tyde mobilnettet logikken bak disse endringene er et grunnleggende mål innen utviklingsbiologi. Oppdagelsen og utvikling av photoconvertible proteiner har sterkt hjulpet vår forståelse av disse dynamiske endringer ved å tilby en metode for å optisk markere celler og vev. Men mens photoconversion, time-lapse mikroskopi og påfølgende bildeanalyser har vist seg for å være svært vellykket i å avdekke mobilnettet dynamikk i organer som hjernen eller øyet, brukes denne tilnærmingen ikke vanligvis i utviklingsland hjertet grunn utfordringer som rask bevegelse av hjertet under cardiac syklus. Denne protokollen består av to deler. Første del beskriver en metode for photoconverting og senere sporing endocardial celler (EdCs) under sebrafisk atrioventrikulær kanalen (AVC) og atrioventrikulær hjertet ventil utvikling. Metoden innebærer timelig stoppe hjertet med et medikament for at nøyaktig photoconversion finne sted. Hjerter er tillatt å gjenoppta juling på fjerning av stoffet, og embryonale utvikling fortsetter som normalt til hjertet stoppes igjen ved høy oppløsning avbildning av photoconverted EdCs på en senere utviklingsmessige tidspunkt. Den andre delen av protokollen beskriver en bildet analysemetode for å kvantifisere lengden på et photoconverted eller ikke-photoconverted område i AVC i unge embryoer ved å tilordne fluorescerende signalet fra tredimensjonale strukturen til et todimensjonalt kart . Sammen de to delene av protokollen tillater en å undersøke opprinnelsen og oppførsel av celler som utgjør sebrafisk AVC og atrioventrikulær hjerteklaffen, og kan potensielt bli brukt for å studere mutanter, morphants eller embryo som har blitt behandlet med reagenser som forstyrrer AVC og/eller ventil utvikling.
Introduction
Sebrafisk er en av de viktigste virveldyr modellene å studere mobilnettet og utviklingsmessige prosesser i vivo. Dette skyldes den sebrafisk optisk åpenhet og amenability til genetikk, som gjør det en effektiv modell for bruk optisk teknikker med genetisk kodet photoresponsive protein teknologier1. Spesielt til studiet av heart utvikling, sebrafisk få tilstrekkelig oksygen via diffusjon slik at selv mutanter uten hjerterytme kan overleve gjennom den første uken i utvikling, tillater analyser på virkningene av utviklingsmessige gener og plaget blodstrøm på hjertet morphogenesis ikke mulig i de fleste virveldyr2.
Sebrafisk hjertet røret er dannet av 24 timer innlegget befruktning (hpf). Kort tid etter dannelsen begynner hjertet røret aktivt slo. Med 36 hpf, en klar innsnevring skiller atrium fra ventrikkel. Dette området av innsnevring kalles atrioventrikulær kanalen (AVC), og celler i denne regionen endringen fra en squamous morfologi til kubisk morfologi3. Sebrafisk atrioventrikulær ventil morphogenesis starter rundt 48 h legge befruktning. 5 dager post befruktning, to ventil brosjyrer utvide til AVC og forhindre tilbake flyten av blod fra ventrikkel til atriet under cardiac syklus4. Spore celler under AVC og ventil formasjon er utfordrende rask juling av hjertet gjør det vanskelig å følge celler via tradisjonelle time-lapse mikroskopi5,6. Denne protokollen, tilpasset fra Steed et al., 20167, beskriver en metode som bruker vs (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 sebrafisk transgene linjen, som photoconvertible protein Kaede uttrykkes i endotelceller, inkludert endocardium. Den narkotika 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) brukes til å midlertidig stoppe hjertet slo, slik at nøyaktig photoconversion av EdCs mellom 36 og 55 hpf og høy oppløsning avbildning av photoconverted EdCs på bestemte utviklingsmessige tidspunkt. Det har tidligere vært vist at EdCs photoconverted på denne måten kan forbli skilles fra sine uomvendte naboer i fem dager eller mer etter photoconversion7. Denne protokollen også detaljer en metode som brukes for bildeanalyse av photoconverted EdCs i embryoer yngre enn 48 hpf, som har blitt brukt til å følge vev bevegelser under AVC utvikling (Boselli et al., under trykking)9. Vi håper at leserne vil finne denne protokollen nyttig for å studere AVC og ventil utvikling i normal embryoer og mutanter, morphants eller narkotika-behandlet embryoer. For en mer generell protokoll knyttet til celle sporing ved hjelp av photoconvertible proteiner under sebrafisk utvikling, se artikkelen av Lombardo et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
Timing av photoconversion: selv om Kaede er fortsatt sterkt uttrykkes i EdCs på 96 hpf, bør det bemerkes at som fosteret vokser, laserlys diffunderer mer før den når AVC, gjør begrenset photoconversion av Kaede vanskeligere. At embryonale stadier senere enn 55 hpf, ballooning av ventrikkel og atrium også betyr at fiolett laserstrålen som brukes for photoconversion ikke kan nå AVC celler uten første går gjennom enten atrium eller ventrikkel. Dette betyr at utover 55 hpf, for photoconvert EdCs av AVC, en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli og Basile Gurchenkov for å utforme og lage mold beskrevet i denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO unge etterforsker Program, EU, ERC CoG N ° 682938 Evalve og av stipendet ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk Statens fondet forvaltes av Agence Nationale de la Recherche under ramme programmet Investissements d’Avenir merket ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
Riferimenti
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
