Summary

توليد النباتات المعدلة وراثيا مع الملاحق نسخة واحدة باستخدام ناقل ثنائي بيبك-GW

Published: March 28, 2018
doi:

Summary

باستخدام ناقل ثنائي ببيباك-GW يجعل توليد النباتات المعدلة وراثيا مع الملاحق نسخة واحدة سليمة، عملية سهلة. هنا، يقدم سلسلة من البروتوكولات التي ترشد القارئ من خلال عملية توليد نبات النباتات المعدلة وراثيا، واختبار نباتات إينتاكتنيس ونسخ عدد من إدراج.

Abstract

عند توليد النباتات المعدلة وراثيا، عموما الهدف أن يكون تعبير مستقر التحوير. وهذا يتطلب تكامل واحد، سليمة من التحوير، كما نسخ متعددة من التكامل غالباً ما يتعرضون لإسكات الجينات. ناقل ثنائي متوافق مع العبارة استناداً إلى الصبغيات الاصطناعية البكتيرية (ببيباك-GW)، مثل مشتقات ببيباك أخرى، يسمح إدراج المتسلسلات نسخة واحدة بكفاءة عالية. كما تحسن إلى ببيباك الأصلي، قد تم استنساخ كاسيت عبارة في ببيباك-غيغاواط، حيث أن تسلسل الفائدة يمكن الآن يسهل إدراجها في نقل المتجهات الحمض النووي (تي-DNA) باستنساخ بوابة. عادة، نتائج التحول مع ببيباك-GW في كفاءة من 0.2-0.5 في المائة، حيث نصف الوراثي القيام بدمج نسخة واحدة سليمة من T-الحمض النووي. تتوفر ناقلات غيغاواط ببيباك مع المقاومة إلى جلوفوسيناتي الأمونيوم أو دسريد fluorescence في المعاطف البذور للتحديد في النباتات، ومع مقاومة كاناميسين كمجموعة في البكتيريا. هنا، يقدم سلسلة من البروتوكولات التي ترشد القارئ من خلال عملية توليد النباتات المعدلة وراثيا باستخدام ببيباك-GW: بدءاً من إعادة ضم تسلسل الاهتمام داخل المتجهة غيغاواط ببيباك الاختيار، مصنع التحويل مع المتبعة، الانتقاء الوراثي واختبار النباتات لعدد إينتاكتنيس ونسخة من إدراج استخدام الحمض النووي النشاف. هو إيلاء اهتمام لتصميم استراتيجية blotting الحمض النووي الاعتراف التكاملات أحادية ومتعددة كوبي في المكاني الأحادي والمتعدد.

Introduction

عند توليد النباتات المعدلة وراثيا، عادة الهدف أن يكون transgene(s) المتكاملة ستابلي أعرب. وهذا يمكن أن تحققه التكاملات نسخة واحدة سليمة للتحوير. تكاملات متعددة يمكن أن يؤدي لزيادة التعبير عن التحوير، ولكن أيضا لإسكات الجينات. إسكات المتسلسلات على الأرجح إذا كان يتم ترتيب متواليات المدرج في ترادف أو تكرار مقلوب1،2،،من34. تستخدم ناقلات ثنائية مكوك في المتبعة-بوساطة تجارب التحول تقديم تسلسل الاهتمام إلى جينوم النبات. عدد اندماجات في جينوم نبات يعتمد على عدد نسخ ناقل ثنائي في5، tumefaciens المتبعة6. العديد من ناقلات ثنائي استخداماً هي نواقل نسخة عالية، وذلك يسفر عن عدد نسخ التحوير متوسط ارتفاع: نسخ 3.3 إلى 4.9 في نبات5.

يمكن خفض عدد تي-دنا التكاملات باستخدام ناقلات الثنائية التي تحتوي على عدد نسخة منخفضة في توميفاسينس أ، مثل بيبك7، أو بواسطة إطلاق تي الحمض النووي من الكروموسوم توميفاسينس أ- 5. عدد متوسط من التكاملات التحوير في مثل هذه الحالات أقل من 25،،من89،10. نظراً لأن نسخة واحدة في توميفاسينس (أ)، وكذلك في الإشريكيّة القولونية، يمكن الحفاظ على بيبك-المشتقات وتسليم بنيات كبيرة بقدر 150 كيلو بايت11.

غيغاواط المتوافقة بيبك ناقلات10،12 تسمح السهل إدخال الجينات للفائدة في الموجه استخدام بوابة الاستنساخ. استخدام التكنولوجيا بوابة يبسط إلى حد كبير إجراء الاستنساخ، ولكن أيضا يتغلب على المشاكل الشائعة المقترنة كبيرة منخفضة-نسخة-عدد ناقلات13،14، مثل الحمض النووي عائد منخفض، ومجموعة محدودة من قيود فريدة من نوعها المواقع المتوفرة لاستنساخ7،11. مشتقات ببيباك-GW متوفرة مع المقاومة أما إلى جلوفوسيناتي-الأمونيوم (ببيباك-بار-GW) أو دسريد fluorescence في المعاطف البذور (ببيباك-RFP-GW) للتحديد في النباتات (الشكل 1)10،12. لكل ناقلات، كجينات مقاومة كاناميسين علامة اختيار في البكتيريا.

الجمع بين ناقلات غيغاواط ببيباك: (1) سهل التصميم والتلاعب بالجينات في كولاي، واندماجات نسخة واحدة (2) سليمة في بﻻنتا بكفاءة عالية. العائد ناقلات غيغاواط ببيباك على التكامل المتوسط 1.7 في نبات مع ما يقرب من نصف النباتات المحورة وراثيا تحمل واحدة متكاملة تي-دنا10.

تعبير مستقر المتسلسلات شرطا لمعظم الوراثي التي تم إنشاؤها. تعبير مستقر التحوير يمكن أن تحققه التكاملات سليمة، ونسخة واحدة. بيد أن العمل مع النباتات المعدلة وراثيا تحمل التكاملات سليمة، ونسخة واحدة من أكثر أهمية إذا كان على سبيل المثال، يهدف إلى دراسة كفاءة العمليات المستندة إلى الكروماتين، مثل الطفرات وممارسو، أو إصلاح، والاعتماد على هذه العمليات في موقع جينومي وهيكل الكروماتين في موقع الإدراج. لمصلحتنا، لدراسة اعتماد الطفرات اليغنوكليوتيد الموجهة (ODM) في سياق الجينوم المحلية، كان مجموعة من خطوط مراسل مع التكاملات سليمة، ونسخة واحدة من الجين المراسل الطفرات التي تم إنشاؤها (الشكل 2)10. باستخدام هذه المجموعة من الخطوط، فقد ظهر أن كفاءة ODM يتراوح بين المكاني المعدلة وراثيا المتكاملة في مختلف المواقع الجينوم، على الرغم من مستويات التعبير التحوير بالأحرى مماثلة.

Protocol

1-إدراج تسلسل الاهتمام متجه ثنائي تعد “بوابة الدخول” وناقلات ثنائي. عزل ناقلات “إدخال العبارة” يحتوي على جزء من الحمض النووي أو الجينات من اهتمام باستخدام مجموعة أدوات الإعداد المصغر وفقا للاقتراحات المقدمة المورد.ملاحظة: متجهات بيبك-GW تتطلب استخدام كاناميسين (كم) لل?…

Representative Results

باستخدام نظام بيبك-غيغاواط، مراسل بنيات لدراسة تصنيع التصميم الشخصي في مصانع كانت ولدت10. بنيات صممت في “بوابة دخول” ناقلات بينتر-جنرال موتورز12 وإدراجها في ببيباك–بار-غيغاواط (الشكل 1) استخدام رد فعل جزئ LR العبارة. <p class="jove_content" f…

Discussion

الحاسمة لتوليد الوراثي مع التكاملات واحد، سليمة من التحوير هو خيار ناقل ثنائي المستخدمة. وقد استخدمت ناقلات الأسرة بيبك تسليم متواليات المصالح إلى العديد من النباتات الأنواع23،24،،من2526،،من27<sup…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يدعم هذا البحث الهولندية التكنولوجيا مؤسسة STW (12385)، الذي يشكل جزءا من “منظمة هولندا” للبحث العلمي (NWO)، والذي يمول جزئيا من وزارة “الشؤون الاقتصادية” (مكتب المدعي العام منحة 12385 لمرض التصلب العصبي المتعدد).  ونحن نشكر كارول م. هاملتون (جامعة كورنيل، الولايات المتحدة) لتوفير pCH20، العمود الفقري لناقلات بيبك-غيغاواط.

Materials

Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific – Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific – Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific – Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific – Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

Riferimenti

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
check_url/it/57295?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

View Video